建立孕激素耐药细胞模型
模拟孕激素抵抗以研究其机制
用MPA浓度递增至10 μM处理Ishikawa细胞6个月,建立孕激素耐药细胞系,并通过Western blot验证PR下调、MDR1上调。
IKBKE modulates autophagy and progestin resistance in endometrial cancer.
包含体外细胞实验,包括耐药细胞系建立、IKBKE敲低、抑制剂处理、增殖迁移侵袭检测及自噬分析,但缺少动物模型等体内验证。
人子宫内膜癌Ishikawa细胞系 孕激素耐药Ishikawa细胞系
细胞系:Ishikawa;耐药诱导:MPA浓度递增至10 μM处理6个月 IKBKE敲低:shRNA慢病毒转染,嘌呤霉素筛选(8 μg/mL) CYT387处理浓度:534.5 nM 自噬检测:mRFP-GFP-LC3腺病毒转染,荧光显微镜观察
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
模拟孕激素抵抗以研究其机制
用MPA浓度递增至10 μM处理Ishikawa细胞6个月,建立孕激素耐药细胞系,并通过Western blot验证PR下调、MDR1上调。
确定IKBKE是否与孕激素抵抗相关
通过Western blot和RT-qPCR检测亲本和耐药细胞中IKBKE的蛋白和mRNA水平。
评估IKBKE对耐药细胞增殖、迁移和侵袭的影响
使用shRNA慢病毒转染敲低IKBKE,通过MTT、集落形成、划痕和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。
探究IKBKE是否调控自噬
通过Western blot检测自噬标志物LC3、Beclin-1、ATG5、P62,并用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染观察自噬流。
验证IKBKE抑制剂是否能克服孕激素抵抗
用CYT387处理耐药细胞,检测增殖(MTT)和自噬标志物(Western blot)。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 孕激素耐药诱导 | 醋酸甲羟孕酮 | Sigma-Aldrich Co. | CDAA-S-590045D3 |
| RT-qPCR | 5×gDNA消化混合液 | Yeasen | -- |
| Hifair® III SuperMix Plus试剂盒 | Yeasen | -- | |
| Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen | -- | |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | -- | -- |
| 快速封闭液 | Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 孕激素受体抗体 | Zen Bio | 5264 | |
| IKBKE抗体 | Cell Signaling Technology | 3416 | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 3868 | |
| ATG5抗体 | Cell Signaling Technology | 2630 | |
| Beclin-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3495 | |
| P62抗体 | Cell Signaling Technology | 5114 | |
| MDR1抗体 | Cell Signaling Technology | 13342 | |
| β-actin抗体 | ABclonal | ac-026 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Pierce | -- | |
| 细胞转染 | 携带IKBKE shRNA的腺病毒 | OBiO Technology | HYKY-230307016-DLV |
| IKBKE敲低慢病毒 | Shanghai Heyuan Biology Co., Ltd. | -- | |
| 自噬检测 | mRFP-GFP-LC3腺病毒 | -- | -- |
| DAPI | -- | BL105A | |
| 荧光显微镜 (DM IL LED) | Leica | -- | |
| 集落形成实验 | Leica DMi1显微镜 | Leica | -- |
| 药物处理 | CYT387 | -- | -- |
| 自噬抑制 | 氯喹 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与耐药诱导 | 细胞系来源;MPA浓度递增方案(10 μM)及处理时长(6个月);DMSO浓度(0.1%) 阅读提示:Materials and Methods 2.1和2.2 |
| 基因敲低 | shRNA靶序列;慢病毒滴度(3×10^8 PFU/mL);感染时细胞密度(5×10^4 cells/well);嘌呤霉素浓度(8 μg/mL)和处理时间 阅读提示:Materials and Methods 2.5和2.11 |
| 细胞功能实验 | MTT细胞密度(1×10^4 cells/well)和检测时间点(24、48、72h);划痕实验细胞密度(1×10^6 cells/well)和观察时间(24h);Transwell细胞密度(3×10^4 cells/well)和孔径(8 μm);集落形成细胞密度(200-1000 cells/well)和培养时间(2周) 阅读提示:Materials and Methods 2.6-2.9 |
| 自噬检测 | mRFP-GFP-LC3腺病毒转染细胞密度(1×10^4 cells/well)和处理时间(MPA 10 μM 24h);CQ处理浓度和时间 阅读提示:Materials and Methods 2.10;Results 3.3 |
| 抑制剂处理 | CYT387浓度(534.5 nM)和处理时间 阅读提示:Results 3.4 |