药物筛选
鉴定对HCC细胞具有抑制活性的组蛋白去甲基化酶抑制剂。
使用表观遗传药物库（含36种抑制剂）处理HepG2细胞，通过CCK-8法检测细胞活力，筛选出抑制率最高的Corin。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Corin：一种KDM1A/HDAC1双重抑制剂，通过触发铜死亡抑制肝细胞癌
Corin: a dual inhibitor for KDM1A/HDAC1, suppresses hepatocellular carcinoma by triggering cuproptosis.
实验完整度
中包含药物筛选、细胞活力测定、克隆形成、基因沉默、蛋白印迹、流式细胞术及生物信息学分析，但缺乏体内动物模型验证，实验完整度中等。
主要模型
HepG2细胞 Hep3B细胞 THLE-2细胞（非癌细胞）
重点核对
HepG2和Hep3B细胞系来源（ATCC）及培养条件 Corin处理浓度（0.3 μM和0.6 μM） 基因沉默靶序列（shHDAC1和shKDM1A） 细胞活力检测方法（CCK-8）及处理时间（96小时）
摘要
肝细胞癌（HCC）占所有肝脏病例的90%以上，并且通常对常规治疗方式（包括多激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂）反应不佳。因此，迫切需要为HCC开发新的治疗方案。在本研究中，我们进行了组蛋白去甲基化酶抑制剂的高通量筛选，用于HCC治疗。在所检查的抑制剂中，Corin显著抑制了两种HCC细胞系HepG2和Hep3B的生长和增殖，而不影响非癌细胞。基于Corin的靶点，我们确定了HDAC1/KDM1A双阳性HCC为HCC的一种新亚型。转录组分析表明，这种新亚型具有快速增殖和高DNA损伤修复能力。此外，Corin处理上调FDX1表达以触发铜死亡，从而抑制HCC增殖。总之，Corin作为同时抑制KDM1A和HDAC1表达的HCC新型有效治疗选择具有潜在应用前景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索组蛋白去甲基化酶抑制剂对肝细胞癌（HCC）的治疗潜力及其作用机制。
- 核心机制
- Corin通过上调FDX1表达触发铜死亡（cuproptosis），从而抑制HCC细胞增殖。
- 主要证据
- Corin处理显著抑制HepG2和Hep3B细胞活力及克隆形成；Corin上调FDX1表达，且FDX1敲低后Corin的抑制作用消失；HDAC1/KDM1A双阳性HCC亚型具有较差的临床预后。
- 研究意义
- Corin可能成为同时靶向KDM1A和HDAC1的HCC新型治疗选择，且铜死亡诱导剂在HCC治疗中具有潜在应用价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞增殖抑制验证
验证Corin对HCC细胞增殖的抑制作用及其选择性。
测定Corin对HepG2和Hep3B细胞的IC50，并进行克隆形成实验评估长期增殖能力，同时检测Corin对非癌细胞THLE-2的影响。
靶点验证
验证Corin的抗增殖作用是否依赖于对HDAC1和KDM1A的抑制。
通过慢病毒介导的shRNA敲低HDAC1和KDM1A（单独或联合），进行克隆形成实验，并观察Corin对敲低细胞的影响。
临床相关性分析
评估KDM1A和HDAC1在HCC中的表达及预后价值，定义HDAC1/KDM1A双阳性亚型。
利用TCGA和GSE14520数据集分析KDM家族表达及与预后的关系，并通过CPTAC蛋白组学数据验证蛋白水平，进行生存分析。
机制研究
阐明Corin抑制HCC增殖的机制是否为诱导铜死亡（cuproptosis）。
观察Corin处理的细胞形态变化，通过7-AAD染色检测细胞死亡，并使用凋亡、坏死性凋亡和铁死亡抑制剂排除已知死亡类型；检测FDX1表达及与KDM1A/HDAC1的相关性；通过FDX1敲低验证Corin的作用依赖性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| THLE-2专用培养基 | Procell | CM-0833 | |
| 药物筛选 | 表观遗传药物 | MedChemExpress | -- |
| 细胞培养 | 硫酸鱼精蛋白 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | ApexBio | K1018 |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Invitrogen | 89900 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen | 20201ES86 | |
| Tris-甘氨酸凝胶 | Yeasen | 36252ES10 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 抗KDM1A抗体 | CST | 4218 | |
| 抗FDX1抗体 | Abclonal | A20895 | |
| 抗β-actin抗体 | Abclonal | AC038 | |
| 抗HDAC1抗体 | Abclonal | A0238 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abclonal | A19056 | |
| 细胞死亡检测 | 7-AAD染液 | -- | -- |
| 细胞死亡抑制 | Z-VAD-FMK（凋亡抑制剂） | -- | -- |
| 坏死性凋亡抑制剂 | -- | -- | |
| Ferrostatin-1（铁死亡抑制剂） | -- | -- | |
| 流式分析 | NovoCyte流式细胞仪 | -- | -- |
| 蛋白质印迹 | Image Lab软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC、Procell）、培养基（DMEM、THLE-2专用培养基）、FBS浓度（10%）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods中的'Cell culture'部分 |
| 药物筛选 | Corin浓度（10 μM）、细胞密度（3000细胞/孔）、处理时间（24小时）、细胞活力检测方法（CCK-8） 阅读提示：Materials and methods中的'Drug screening'部分 |
| IC50测定 | Corin浓度梯度（10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625 μM）、处理时间（96小时）、细胞密度（3000细胞/孔） 阅读提示：Materials and methods中的'Half-maximal inhibitory concentration (IC50) determination'部分 |
| 克隆形成实验 | 细胞密度（10000细胞/孔）、Corin浓度（0.3和0.6 μM）、处理时间（一周）、培养基更换频率（每2天） 阅读提示：Materials and methods中的'Clonogenic assay'部分 |
| 基因沉默 | shRNA靶序列（HDAC1: 5'CGTTCTTAACTTTGAACCATA 3'；KDM1A: 5' GCAGTTGTGGTTGGATAATCC 3'）、转染试剂（protamine sulfate 8 μg/mL）、病毒感染时机（80%汇合度） 阅读提示：Materials and methods中的'Lentivirus-mediated gene silencing'部分 |
| 细胞死亡检测 | Corin浓度（0.6 μM）、7-AAD染色浓度和孵育时间（5 μL 7-AAD于50 μL assay buffer，室温15分钟） 阅读提示：Materials and methods中的'7-Amino-actinomycin D (7-AAD) staining'部分 |
| 蛋白质印迹 | 抗体稀释比（KDM1A 1:1000, FDX1 1:1000, β-actin 1:20000, HDAC1 1:1000, GAPDH 1:10000）、孵育条件（4°C过夜） 阅读提示：Materials and methods中的'Western blot'部分 |
| 统计分析 | 至少三次独立实验、t检验类型（双尾）、软件（GraphPad Prism 8.0） 阅读提示：Materials and methods中的'Statistical analyses'部分 |