aldometanib抑制多种HCC模型的肿瘤生长
评估aldometanib在体内对肝细胞癌的治疗效果。
使用三种HCC小鼠模型（DEN-HFD、MYC;Trp53−/−、Hepa1-6原位移植瘤），通过饮水给予不同剂量aldometanib，评估肿瘤数量、大小、重量及小鼠生存期。
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葡萄糖饥饿模拟物aldometanib清除免疫屏障，使荷肝细胞癌小鼠存活至正常寿命。
Glucose starvation mimetic aldometanib removes immune barriers permitting mice with hepatocellular carcinoma to live to normal ages.
实验完整度
高包含多种独立动物模型（DEN-HFD、MYC;Trp53-/-、原位移植瘤）、体外细胞实验、AMPK基因敲除验证、CD8+ T细胞耗竭/回补及流式细胞术等多层级功能与机制验证。
主要模型
DEN-HFD诱导的原发性肝细胞癌小鼠模型 MYC;Trp53−/−诱导的肝细胞癌小鼠模型 Hepa1-6细胞原位移植瘤小鼠模型 患者来源的HCC细胞异种移植瘤模型
重点核对
aldometanib给药剂量：50-150 mg/L（饮水中），约6-10 mg/kg/天 AMPK激活水平：通过检测肝脏组织中p-AMPKα (Thr172)和p-ACC (Ser79)磷酸化水平 CD8+ T细胞浸润：通过免疫组织化学和流式细胞术检测肿瘤组织中CD8a+细胞的比例 AMPKα敲除：使用肝脏特异性AMPKα1/α2双敲除小鼠（AMPKα-LKO）验证AMPK依赖性 CD8+ T细胞耗竭：使用抗CD8a中和抗体处理，验证CD8+ T细胞在肿瘤抑制中的必要性
摘要
肿瘤组织及瘤旁组织中的代谢失调均可导致免疫抑制，这可能是癌症发生的基础。然而，代谢干预作为一种治疗策略迄今未见成效。在本研究中，我们探索了aldometanib的抗癌治疗效果，该药物特异性靶向溶酶体相关的醛缩酶以模拟葡萄糖饥饿，从而激活溶酶体AMP活化蛋白激酶（AMPK），AMPK是代谢稳态的主要调节因子。我们发现，aldometanib以AMPK依赖的方式抑制肝细胞癌（HCC）的生长，使荷瘤小鼠能够存活至成熟年龄，尽管aldometanib对HCC细胞或正常细胞不具有细胞毒性。有趣的是，aldometanib仅在免疫健全的宿主小鼠中发挥抗癌作用，而在免疫缺陷小鼠中则无此作用。我们还发现，aldometanib处理的小鼠HCC组织中有大量CD8+ T细胞浸润，而在肝脏特异性敲除AMPKα的小鼠中则未观察到这一现象。因此，我们的研究结果表明，代谢调节因子AMPK重新平衡肿瘤微环境，使体内的细胞毒性免疫细胞能够消除癌细胞并有效控制肿瘤组织。代谢干预能使癌症成为一种终身可控的疾病，这一发现可能开启癌症治疗的新时代。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究通过靶向溶酶体醛缩酶模拟葡萄糖饥饿的aldometanib，是否能够通过纠正肿瘤微环境中的代谢失调来抑制肝细胞癌（HCC），并阐明其作用机制。
- 核心机制
- aldometanib特异性激活溶酶体AMPK，改善肿瘤微环境，清除免疫屏障，促进细胞毒性CD8+ T细胞向肿瘤组织浸润和活化，从而以AMPK依赖的方式抑制HCC生长。
- 主要证据
- 研究发现，aldometanib在DEN-HFD、MYC;Trp53−/−及原位移植瘤等多种HCC小鼠模型中均能抑制肿瘤生长并延长生存期，且此效应依赖宿主肝脏（非肿瘤）中的AMPK。关键证据包括：AMPKα-LKO小鼠中aldometanib的抑瘤作用消失，CD8+ T细胞在aldometanib处理的肿瘤中大量浸润，且CD8+ T细胞耗竭后aldometanib的抑瘤作用显著减弱，而回补人PBMC则恢复其疗效。
- 研究意义
- 该研究表明，通过代谢干预（如aldometanib）使癌症成为一种可长期管理的慢性疾病，可能为癌症治疗开启新时代，并为免疫治疗提供新的联合策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证AMPK在aldometanib抑瘤作用中的必要性
确定aldometanib的抑瘤作用是否依赖于AMPK，并区分肿瘤组织与宿主肝脏中AMPK的作用。
使用肝脏特异性AMPKα敲除小鼠（AMPKα-LKO）和AMPKα−/− Hepa1-6细胞，建立DEN-HFD模型和原位移植瘤模型，观察aldometanib的抑瘤效果。
评估aldometanib的体外细胞毒性
检测aldometanib是否直接对肿瘤细胞或正常细胞具有细胞毒性。
使用多种肝癌细胞系（Hepa1-6、Huh7、JHH-7）及正常肝细胞（BNL、原代小鼠肝细胞），在不同浓度aldometanib处理后，通过流式细胞术检测细胞凋亡、坏死及总细胞死亡。
研究aldometanib对肿瘤浸润免疫细胞的影响
探究aldometanib诱导的AMPK激活如何改变肿瘤微环境，尤其是CD8+ T细胞的浸润和功能。
通过流式细胞术和免疫组化分析aldometanib处理的HCC组织中多种免疫细胞（CD8+ T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等）的比例和数量，并检测CD8+ T细胞的活化标志物和效应功能。
验证CD8+ T细胞在aldometanib抑瘤作用中的关键作用
确认CD8+ T细胞是否介导aldometanib的体内抑瘤效果。
通过抗体介导的CD8+ T细胞耗竭、免疫缺陷小鼠模型以及人源化小鼠模型，观察aldometanib抑瘤效果的变化。
评估aldometanib与免疫治疗联用的效果
探究aldometanib是否能增强HCC对免疫检查点抑制剂（抗PD-1）的敏感性。
在Hepa1-6原位移植瘤模型中，联合使用aldometanib和抗PD-1抗体，评估对肿瘤生长的抑制作用。
分析aldometanib对趋化因子表达的影响
探索aldometanib诱导CD8+ T细胞浸润的可能机制，尤其是趋化因子（CXCL9/10/11）的作用。
通过RT-PCR和RNA测序分析aldometanib处理后肿瘤及瘤旁组织中趋化因子mRNA水平的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Aldometanib | MedChemExpress | HY-148189 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Scientific | 12800082 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T1426 | |
| 原代细胞分离 | 肝脏灌注培养基 | Thermo Scientific | 17701 |
| 肝脏消化培养基 | Thermo Scientific | 17703 | |
| I型胶原酶 | Sigma | C0130 | |
| 细胞培养 | Y-27632 | Sigma | Y0503 |
| 聚凝胺 | Sigma | H9268 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Scientific | 11668500 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 | |
| 药物处理 | Kolliphor HS 15 | Sigma | 42966 |
| 二乙基亚硝胺 | Sigma | N0756 | |
| 动物实验 | 玉米油 | Sigma | C8267 |
| 高脂饮食 | Research Diets | D12492 | |
| 抗小鼠CD8a中和抗体（克隆2.43） | BioXCell | BE0061 | |
| 抗小鼠CD4中和抗体（克隆GK1.5） | BioXCell | BP0003-1 | |
| 抗小鼠PD-1抗体（克隆RMP1-14） | BioXCell | BE0146 | |
| 流式细胞术 | Annexin V凋亡检测试剂盒 | eBioscience | 88-8007-74 |
| 流式细胞仪（LSRFortessa X20） | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD8a-APC抗体 | eBioscience | 17-0081-82 | |
| 抗CD8a-Alexa Fluor 488抗体 | BioLegend | 100723 | |
| 抗CD45-PerCP-Cy5.5抗体 | eBioscience | 45-0451-82 | |
| 抗CD45-Alexa Fluor 488抗体 | eBioscience | 53-0451-82 | |
| 抗颗粒酶B-PE抗体 | eBioscience | 12-8898-82 | |
| 抗IFNγ-PE-CF594抗体 | BD Biosciences | 562303 | |
| 抗CD16/CD32抗体 | Invitrogen | 14-0161-86 | |
| 免疫组织化学 | 抗Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 12202 |
| 抗AFP抗体 | Proteintech | 14550-1-AP | |
| SignalStain DAB底物试剂盒 | Cell Signaling Technology | 8059 | |
| 蛋白质印迹 | 抗磷酸化AMPKα (Thr172)抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 抗磷酸化ACC (Ser79)抗体 | Cell Signaling Technology | 3661 | |
| 抗ACC抗体 | Cell Signaling Technology | 3662 | |
| 抗磷酸化p70 S6K (Thr389)抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| PVDF膜 | Merck | IPVH00010 | |
| ECL化学发光液 | Advansta | 210414-73 | |
| RNA提取与定量 | TRIzol试剂 | Thermo Scientific | 15596018 |
| Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液 | Thermo Scientific | K0223 | |
| RNA测序 | NEBNext Poly(A) mRNA磁分离模块 | New England Biolabs | E7490L |
| NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7770L | |
| 代谢物测量 | QTRAP 6500+质谱仪 | SCIEX | -- |
| ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 | Waters | 186002350 | |
| ZIC-pHILIC色谱柱 | Millipore | 1.50462.0001 | |
| 组织学 | 伊红Y溶液 | ZSGB-BIO | ZLI-9613 |
| TUNEL凋亡检测试剂盒 | Yeason | 40307ES60 | |
| 血液生化分析 | ALT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 |
| AST检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
| 血糖测量 | 葡萄糖氧化酶检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | GAGO20 |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen | 20201ES86 |
| 细胞实验 | 结晶紫 | Solarbio | G1072 |
| Transwell小室 | Corning | CLS3422 | |
| 基质胶 | Corning | 356230 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| aldometanib配制与给药 | 需核对aldometanib的配制方法（体外实验用DMSO溶解，体内实验用10% Kolliphor HS 15配制）、给药浓度（50-150 mg/L，约6-10 mg/kg/天）及给药途径（饮水自由饮用） 阅读提示：请参阅Materials and methods中的'Formulation of aldometanib'部分及Figure 1图注 |
| HCC模型建立 | 需核对各HCC模型的建立方法，包括DEN剂量（80mg/kg，4周龄和5周龄各一次）、HFD开始时间（第二次DEN注射后2周）、MYC;Trp53−/−模型的水动力注射质粒构成（pX330-sg-p53、PT3-EF1a-Myc、pCMV/SB10）及CCl4处理（5mL/kg，每周两次，共3周）、Hepa1-6原位移植的细胞数量（1.5×10^6）和注射部位（左肝叶） 阅读提示：请参阅Materials and methods中的'HCC-HFD, MYC;Trp53−/− mice and HCC orthotopic allografts'部分及Figure 1图注 |
| AMPK活性检测 | 需核对组织/细胞裂解和蛋白提取方法（不含磷酸酶抑制剂？）、所用抗体（p-AMPKα Thr172、p-ACC Ser79）及检测方法（免疫印迹） 阅读提示：请参阅Materials and methods中的'Immunoblotting'部分及Supplementary Figure S1图注 |
| CD8+ T细胞浸润检测 | 需核对HCC组织消化方法（I型胶原酶）、细胞分离（40%/80% Percoll梯度离心）、流式抗体选择（CD8a-APC/Alexa Fluor 488、CD45-PerCP-Cy5.5）及数据分析（绝对数量或比例） 阅读提示：请参阅Materials and methods中的'Determination of the composition of immune cells in HCC tissues'部分及Figure 4图注 |
| CD8+ T细胞功能分析 | 需核对CD8+ T细胞活化状态检测标志物（CD62L、CD44）、效应分子（granzyme B、IFNγ）检测及流式分析策略（胞内染色） 阅读提示：请参阅Materials and methods中的'Determination of the composition of immune cells in HCC tissues'部分及Supplementary Figure S8图注 |