临床样本分析
鉴定与男性不育相关的差异表达蛋白，并验证PRDX1表达与临床病理的相关性
对NOA和OA患者的睾丸活检组织进行iTRAQ蛋白质组学分析，筛选差异表达蛋白；通过免疫组化、组织微阵列、免疫荧光和BODIPY染色验证PRDX1表达、定位及脂质积累
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PRDX1通过调控ATG4B的氧化还原状态调节脂自噬，促进睾酮合成并延缓衰老
PRDX1 promotes testosterone synthesis and attenuates aging via redox regulation of ATG4B to modulate lipophagy.
实验完整度
高包含临床样本分析、细胞系实验、转基因小鼠模型、多组学分析及体外生化实验，并进行功能验证和机制验证，证据层级多且相互独立
主要模型
非梗阻性无精子症（NOA）患者睾丸活检组织 Prdx1条件敲除小鼠（Sf1-Cre; Prdx1loxP/loxP） TM3小鼠间质细胞系（Prdx1敲低） HEK293细胞（过表达或突变体转染）
重点核对
NOA患者中PRDX1表达降低与血清睾酮降低及脂质积累相关 LC特异性敲除Prdx1导致成年小鼠早发性睾丸衰老和不育 PRDX1通过Cys52和Cys173与ATG4B的Cys78相互作用，调控ATG4B去脂化活性 依布硒啉可恢复H2O2抑制的ATG4B去脂化活性并改善老年小鼠LOH症状
摘要
睾酮不足会破坏精子发生并加速男性衰老。自噬促进睾酮合成。然而，自噬相关蛋白4同源物B（ATG4B）的分子还原机制尚未建立。在此，我们揭示过氧化物还原蛋白1（PRDX1）与男性生育障碍具有临床相关性。成人间质细胞（LC）特异性缺失Prdx1基因的突变小鼠表现出早发性睾丸衰老和不育。一系列体内和体外实验结合多组学分析表明，PRDX1失活损害LC中的脂自噬和睾酮合成。机制上，PRDX1中的Cys52和Cys173特异性靶向ATG4B中的氧化还原位点Cys78，以保持ATG4B中Cys74的去脂化活性，从而促进自噬流。此外，PRDX1功能障碍加剧了老年小鼠的睾丸和系统性衰老，这可以通过2-半胱氨酸模拟物依布硒啉缓解。总之，我们的研究结果表明PRDX1通过调控ATG4B促进脂自噬和睾酮合成。我们的研究还提出了依布硒啉在预防和治疗衰老相关疾病（包括迟发性性腺功能减退症）中的潜在应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PRDX1是否以及如何通过调控ATG4B的氧化还原状态来调节脂自噬和睾酮合成，并影响睾丸衰老和迟发性性腺功能减退（LOH）？
- 核心机制
- PRDX1通过其Cys52和Cys173与ATG4B的Cys78形成氧化还原依赖性相互作用，保护ATG4B的Cys74催化活性，从而维持LC3II的去脂化，促进自噬体成熟和脂自噬，进而促进胆固醇利用和睾酮合成；PRDX1失活导致ATG4B功能受损，脂自噬受阻，胆固醇积累，睾酮合成不足
- 主要证据
- 临床NOA样本中PRDX1降低；LC特异性敲除小鼠显示早发性睾丸衰老和不育；TM3敲低细胞显示自噬流受阻和脂质积累；体外去脂化实验显示PRDX1和依布硒啉恢复H2O2抑制的ATG4B活性；老年小鼠模型中依布硒啉改善LOH相关症状
- 研究意义
- 揭示PRDX1作为ATG4B的氧化还原调节因子在脂自噬和睾酮合成中的关键作用，并提出依布硒啉作为治疗睾酮缺乏和LOH的潜在策略
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建Prdx1条件敲除小鼠模型
研究PRDX1在间质细胞中的生理功能
使用Sf1-Cre和Prdx1loxP/loxP杂交产生LC特异性Prdx1敲除（cKO）小鼠，验证敲除效率，并分析小鼠生育能力、精子参数、间质细胞形态及睾酮水平
脂质积累和自噬功能分析
探究Prdx1缺失导致睾酮不足的原因，尤其是脂质积累和自噬功能
检测cKO小鼠和对照小鼠的激素水平、类固醇生成酶基因表达、脂质含量、脂滴形态、自噬标志物及自噬流
TM3细胞中PRDX1敲低的功能验证
在细胞水平验证PRDX1对脂自噬的调控作用
使用慢病毒介导shRNA稳定敲低TM3细胞中的Prdx1，通过Western blot、免疫荧光、LC3双荧光、活细胞成像等方法检测自噬流和脂自噬
分子机制解析
确定PRDX1调控自噬的分子机制，特别是与ATG4B的相互作用
通过共免疫沉淀、GST pull-down、体外去脂化实验，定位PRDX1和ATG4B中关键半胱氨酸残基，并验证PRDX1对ATG4B活性的调控
老年小鼠体内验证
评估PRDX1缺失对老年小鼠睾丸衰老和LOH表型的影响，以及依布硒啉的干预效果
对20月龄的cKO和Ctrl小鼠使用依布硒啉治疗1个月，或使用LC特异性过表达PRDX1的小鼠，检测睾丸形态、精子参数、睾酮水平、自噬和脂自噬标志物，以及行为、运动和代谢指标
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学 | iTRAQ | Applied Biosystems | -- |
| 组织染色 | 油红O | Solarbio | -- |
| 脂质染色 | BODIPY 493/503 | Thermo Fisher Scientific | D3922 |
| 细胞衰老检测 | β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Solarbio | G1580 |
| 细胞凋亡检测 | DeadEnd™荧光TUNEL系统 | Promega | G3250 |
| Western blot | 二硫苏糖醇 | Beyotime | ST045 |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Sangon Biotech | C503021 | |
| ECL化学发光底物试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 36222ES | |
| 激素测量 | ELISA试剂盒 | ELK Biotechnology | ELK2368, ELK10254 |
| 胆固醇测量 | 胆固醇检测试剂盒 | Abcam | ab102515 |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 马血清 | Solarbio | S9050 | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| 原代细胞分离 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 |
| Percoll | Cytiva | 17-0891-02 | |
| 自噬抑制 | 3-甲基腺嘌呤 | MedChemExpress | HY-18234 |
| 氯喹 | MedChemExpress | HY-18234 | |
| 胃蛋白酶抑制剂A | MedChemExpress | HY-P0018 | |
| 亮抑酶肽 | MedChemExpress | HY-18234 | |
| 自噬激活 | 雷帕霉素 | MedChemExpress | HY-10219 |
| 自噬抑制 | MRT68921 | -- | HY-100006 |
| 巴弗洛霉素A1 | -- | HY-100558 | |
| 脂蛋白实验 | Dil标记的高密度脂蛋白 | Solarbio | IL2170 |
| 动物模型 | D-半乳糖 | Solarbio | SG8010 |
| 药物处理 | 依布硒啉 | MedChemExpress | HY-13750 |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | -- | -- |
| HRP标记二抗 | Jackson Immunoresearch | -- | |
| 共聚焦显微镜 | FluoView FV1000共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| 活细胞成像 | LSM980+ Airyscan系统 | Zeiss | -- |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜H-7500 | Hitachi | -- |
| 蛋白纯化 | GST标签蛋白纯化试剂盒 | Beyotime | P2262 |
| His标签蛋白纯化试剂盒 | Beyotime | P2247 | |
| GSH琼脂糖磁珠 | Beyotime | P2258 | |
| 蛋白表达 | 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷 | Solarbio | I8070 |
| 酶活测定 | 重组ATG4B蛋白 | -- | -- |
| 重组PRDX1蛋白 | Proteintech | Ag8821 | |
| 行为分析 | VersaMax动物活动监测仪 | -- | -- |
| 骨密度测量 | Micro-CT系统μCT 80 | Scanco Medical | -- |
| 血液分析 | 全自动血液分析仪Sysmex KX.21 | Sysmex | -- |
| 生化分析 | 自动生化分析仪IDEXX Catalyst One | IDEXX | -- |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Yeasen | 19221ES |
| 逆转录 | cDNA合成试剂盒 | Yeasen | 11141ES |
| qRT-PCR | SYBR Green预混液 | Yeasen | 11203ES |
| StepOne Plus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | NOA和OA患者的睾丸活检组织，血清睾酮水平，PRDX1表达定位 阅读提示：Methods部分'Testicular biopsy collection, proteomics analyses and testicular tissue microarray'及图1 |
| 小鼠模型 | Prdx1条件敲除小鼠（Sf1-Cre, Prdx1loxP/loxP）的构建和基因型确认；对照组为Sf1-Cre阴性、Prdx1loxP/loxP纯合小鼠 阅读提示：Methods部分'Animals, husbandry and genotyping'及图2 |
| 细胞模型 | TM3细胞培养条件（DMEM/F12，5%马血清，2.5%FBS）；HEK293细胞培养条件（DMEM，10%FBS）；稳定敲低PRDX1的shRNA序列，过表达质粒及突变体 阅读提示：Methods部分'Cell lines, culture and treatments'及图4 |
| 自噬检测 | 自噬抑制剂（3-MA, CQ, PA, LP, Rapa, MRT68921, Baf）的处理浓度和时间；LC3-GFP-RFP双荧光检测；BODIPY和LC3共染色，LysoTracker和BODIPY共染色，蛋白激酶K和Triton X-100实验 阅读提示：Methods部分'Cell lines, culture and treatments'、'Proteinase K and Triton X-100 assay'及图4 |
| 分子机制验证 | PRDX1和ATG4B的突变体（C52A, C173A, C83A, C52A/C173A, C74S, C78S）的构建和表达；体外去脂化实验中H2O2、PRDX1、依布硒啉的使用浓度 阅读提示：Methods部分'Co-immunoprecipitation'、'Protein expression and purification'、'In vitro assay for ATG4B enzymatic activity'及图6 |
| 老年小鼠干预 | 依布硒啉的给药方案（20 mg/kg/day，腹腔注射，1个月）；D-半乳糖诱导衰老模型（500 mg/kg/day，皮下注射，2个月） 阅读提示：Methods部分'Ebselen treatment'、'Aging mice model induced by D-galactose'及图7 |