建立并验证黑色素瘤相关内皮细胞模型
建立模拟黑色素瘤相关内皮细胞特征的共培养模型，以研究肿瘤细胞对内皮细胞的影响。
使用Transwell共培养体系，将A2058或A375黑色素瘤细胞与HUVEC共培养72小时，建立TA-HUVEC，并通过CCK8、迁移、成管实验和蛋白表达验证其促血管生成表型。
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乳酸介导的组蛋白乳酸化通过IL-33/ST2轴促进黑色素瘤血管生成
Lactate-mediated histone lactylation promotes melanoma angiogenesis via IL-33/ST2 axis.
实验完整度
高包含体外共培养模型、体内异种移植瘤模型、RNA测序、ChIP、双荧光素酶报告基因等实验，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养模型（TA-HUVEC） 小鼠黑色素瘤B16F10异种移植瘤模型 黑色素瘤组织芯片（TMA）
重点核对
TA-HUVEC共培养条件：A2058细胞与HUVEC以Transwell共培养72小时 NALA处理浓度10 mM，A-485处理浓度10 μM B16F10细胞接种量5×10^5，C57BL/6小鼠 药物剂量：FX-11（2.5 mg/kg）、IL-33（10 μg/kg）、A-485（2.5 mg/kg）、DC101（10 mg/kg）、anti-ST2抗体（1 mg/kg） 统计分析：至少三次独立实验，采用t检验或ANOVA
摘要
癌症的发病机制复杂，代谢重编程和血管生成是其标志性特征。近期报道揭示，糖酵解代谢物乳酸可修饰组蛋白乳酸化，从而表观遗传调控癌症中的基因表达和生物学过程，但其对肿瘤血管生成的影响仍不明确。以黑色素瘤为模型，我们首先证明了乳酸和组蛋白乳酸化在体外和体内均能促进黑色素瘤血管生成。然后，通过RNA测序和一系列生化实验，我们发现乳酸通过增强其启动子处的组蛋白乳酸化，促进肿瘤相关内皮细胞中致瘤抑制因子2（ST2）的转录，从而增加内皮细胞对促血管生成的白细胞介素-33（IL-33）刺激的反应。此外，乳酸还能抑制内皮细胞向高内皮微静脉的转变，这对肿瘤发展至关重要。最后，在体内证明了抗血管生成药物与乳酸脱氢酶（LDH）抑制/ST2抑制联合应用对黑色素瘤生长的作用。总之，我们证明了乳酸介导的组蛋白乳酸化通过IL-33/ST2轴促进黑色素瘤血管生成，这描绘了癌症中乳酸、组蛋白乳酸化和血管生成之间的新型调控关系，并从细胞代谢和表观遗传学的角度为靶向血管生成提供了有前景的联合治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乳酸和组蛋白乳酸化如何通过表观遗传调控促进黑色素瘤血管生成，以及其与IL-33/ST2轴的关系。
- 核心机制
- 乳酸通过增强ST2启动子区域H3K18la富集，转录上调ST2表达，增强内皮细胞对IL-33的响应，并通过AKT通路激活促进血管生成。
- 主要证据
- 体外TA-HUVEC功能实验（增殖、迁移、成管）、体内B16F10异种移植瘤模型、RNA-seq、ChIP、双荧光素酶报告实验，以及ST2敲低实验。
- 研究意义
- 揭示了乳酸、组蛋白乳酸化和血管生成之间新型调控关系，为靶向代谢和表观遗传的抗血管生成联合治疗提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证乳酸和组蛋白乳酸化对血管生成的影响
确定外源性乳酸和组蛋白乳酸化是否促进血管生成，并验证其依赖性。
用NALA处理TA-HUVEC，并用A-485抑制组蛋白乳酸化，检测细胞功能变化及H3K18la、CD31、VEGFA表达；在体内用FX-11抑制LDHA或NaHCO3 NPs中和乳酸，观察肿瘤生长和血管变化。
RNA-seq鉴定ST2为关键介导因子
寻找乳酸和组蛋白乳酸化调控血管生成的关键下游分子。
对三种处理（DMSO、NALA、NALA+A-485）的TA-HUVEC进行RNA-seq，分析差异表达基因，通过GO富集、Venn分析聚焦于受体基因，并验证ST2表达变化。
验证ST2启动子组蛋白乳酸化修饰
证实乳酸通过增加ST2启动子H3K18la富集来促进其转录。
通过ChIP实验检测ST2启动子区域H3K18la富集，并用双荧光素酶报告实验验证启动子活性。
体外功能验证IL-33/ST2轴的作用
验证IL-33/ST2轴是否介导乳酸促进的血管生成，并探究其下游信号。
在TA-HUVEC中敲低ST2，用IL-33和NALA处理，检测细胞增殖、迁移、成管能力及磷酸化AKT水平。
体内验证IL-33/ST2轴对血管生成的作用
在体内验证IL-33/ST2轴促进黑色素瘤血管生成，并依赖组蛋白乳酸化。
在B16F10异种移植瘤模型中，给予IL-33或联合A-485，检测肿瘤生长和血管参数。
评估乳酸对高内皮微静脉转化的影响
探究乳酸和组蛋白乳酸化是否影响HEV形成。
用LTβR激动剂抗体诱导TA-HUVEC HEV特征，用NALA和A-485处理，检测MECA-79、PNAd、ICAM1表达；在体内LX-11处理后检测HEV比例。
联合靶向治疗评估
探索LDHA抑制或ST2抑制能否增强抗血管生成药物疗效。
在B16F10模型中，给予DC101单药或联合FX-11或anti-ST2，检测肿瘤生长和血管参数。
临床样本验证
在黑色素瘤患者组织验证组蛋白乳酸化-ST2轴的临床相关性。
对包含18例痣和74例黑色素瘤组织的组织芯片进行IHC染色，分析H3K18la与CD31、VEGFA、ST2表达的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Servicebio | G4511-500ML |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | V900929100 | |
| 药物处理 | 乳酸钠 | Sigma-Aldrich | 71718 |
| A-485 | Selleck | S8740 | |
| IL-33 | MCE | HY-P7041 | |
| FX-11 | GLPBIO | GC34011 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | GLPBIO | GC16384 |
| 动物实验 | 三溴乙醇 | Nanjing Aibei Biotechnology | M2910 |
| 细胞共培养 | Transwell小室（3 μm孔径） | Falcon | 3402 |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0038 |
| 细胞迁移检测 | Transwell小室（8 μm孔径） | Falcon | -- |
| 细胞染色 | 结晶紫 | Beyotime Biotechnology | C0121 |
| 血管形成实验 | 基质胶 | ABW | 0827245 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | CST | 5871 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A55860 | |
| CD31抗体 | Proteintech | 11265-1-AP | |
| VEGFA抗体 | Abcam | ab39638 | |
| H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM-1406RM | |
| ST2抗体 | Merck | ZRT1338 | |
| PNAd抗体 | Abcam | ab111710 | |
| ICAM1抗体 | Abcam | ab53013 | |
| 磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060T | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4691T | |
| β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66240-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 增强化学发光Western blot检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green PCR预混液 | -- | -- |
| 实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA-seq | Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- |
| RNA Nano 6000检测试剂盒 | -- | -- | |
| AMPure XP系统 | -- | -- | |
| cBot簇生成系统 | Illumina | -- | |
| TruSeq PE簇生成试剂盒v3-cBot-HS | Illumina | -- | |
| Illumina Novaseq测序平台 | Illumina | -- | |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 56383 |
| H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM-1427RM | |
| 双荧光素酶报告实验 | pGL3-Basic载体 | Promega | -- |
| pRL-TK海肾荧光素酶对照载体 | Promega | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | NanJing Jiancheng Bioengineering | A019-2-1 |
| 流式细胞术 | 70 µm细胞筛网 | Corning | 352350 |
| Zombie UV活力染料 | Biolegend | 423108 | |
| Fc封闭抗体 | Invitrogen | 14-9161-73 | |
| Pacific Blue标记抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | 103126 | |
| APC标记抗小鼠CD31抗体 | Biolegend | 160210 | |
| Alexa Fluor 488标记抗小鼠MECA-79抗体 | eBioscience | 53-6036-80 | |
| 固定/破膜液 | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| BD LSRFortessa™流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫荧光 | 玻璃底培养皿 | NEST | 706201 |
| 山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | 16210064 | |
| CD31抗体 | Proteintech | 11265-1-AP | |
| H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM-1406RM | |
| ST2抗体 | Abcam | ab25877 | |
| MECA-79抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-19602 | |
| Cy3荧光二抗 | Abcam | ab6939 | |
| Alexa Fluor 488荧光二抗 | Abcam | ab150077 | |
| DAPI染色液 | Abcam | ab285390 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜（LSM 980） | Zeiss | -- | |
| 免疫组化 | SP兔/鼠HRP试剂盒 | CWBIO | CW2069S |
| CD31抗体 | Proteintech | 11265-1-AP | |
| H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM-1406RM | |
| VEGFA抗体 | Abcam | ab39638 | |
| ST2抗体 | Abcam | ab25877 | |
| AEC过氧化物酶底物试剂盒 | Solarbio | A1020 | |
| 动物实验 | 三溴乙醇 | Nanjing Aibei Biotechnology | M2910 |
| OCT成像 | 动物OCT血管成像系统（ISOCTA） | -- | -- |
| 数据分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| GraphPad Prism软件 | -- | -- | |
| MATLAB脚本 | MathWorks | -- | |
| 肿瘤组织芯片 | 肿瘤组织芯片（TMA MME1004j） | Taibsbio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与共培养 | 细胞系来源、共培养比例（A2058 1×10^5细胞/mL vs HUVEC 1×10^5细胞/mL）、共培养时间72小时、培养基DMEM、FBS浓度10% 阅读提示：Methods: Cell culture and reagents; The establishment of melanoma-associated endothelial cells (TA-HUVEC) via co-culture system |
| 药物处理 | NALA浓度10 mM，A-485浓度10 μM，处理时间48小时（体外）；体内给药剂量：FX-11 2.5 mg/kg，IL-33 10 μg/kg，A-485 2.5 mg/kg，DC101 10 mg/kg，anti-ST2 1 mg/kg，给药方式腹腔或瘤内，隔天一次共10天 阅读提示：Methods: Cell culture and reagents; Mice model and treatments; Results: Fig.2, Fig.5, Fig.6 |
| 体外功能实验 | CCK8实验接种密度5×10^3/孔，检测时间0/24/48/72小时；Transwell迁移实验细胞密度4×10^4/mL，用8μm孔径小室，处理48小时，加入丝裂霉素C 5 μg/mL；划痕实验接种6×10^5/孔，加入丝裂霉素C 5 μg/mL，培养24-48小时；成管实验Matrigel 50 μL/孔，细胞3×10^4，培养6小时 阅读提示：Methods: CCK8 assay; Transwell migration assay; Wound healing assay; Tube formation assay |
| 分子机制实验 | ChIP实验使用anti-H3K18la抗体，交联1%甲醛20分钟，微球菌核酸酶消化20分钟，检测ST2启动子区域；双荧光素酶报告实验使用ST2启动子全长构建，共转染1 μg报告质粒和50 ng pRL-TK，处理NALA 10 mM或联合A-485 10 μM 24小时 阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation (ChIP); Dual-luciferase reporter assay |
| 动物实验 | 小鼠品系C57BL/6，雌性，8周龄；接种B16F10细胞5×10^5皮下；肿瘤体积达到30-50 mm³开始给药；肿瘤直径不超过2 cm；样本量n=5；4D-OCT成像参数 阅读提示：Methods: Mice model and treatments; Fig.5, Fig.6 |
| 流式细胞术 | 肿瘤组织单细胞悬液制备使用70 μm筛网；死活染色Zombie UV；抗体稀释倍数：CD45 1:1000，CD31 1:1000，MECA-79 1:1000 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis |
| 临床样本分析 | 组织芯片包含18例痣和74例黑色素瘤；IHC染色使用CD31、H3K18la、VEGFA、ST2抗体；按H3K18la中位数分组比较CD31、VEGFA、ST2表达 阅读提示：Results: The inhibition of LDHA or ST2 increases the efficacy of anti-angiogenic inhibitor in melanoma; Supplementary Fig. S7 |