M2巨噬细胞极化及鉴定
获得M2型巨噬细胞并验证其极化状态。
用PMA将THP-1细胞诱导为M0巨噬细胞，再用IL-4和IL-13诱导为M2型；通过流式细胞术检测CD80、CD206，通过qRT-PCR检测iNOS、Arg1、IL-10、TGF-β表达。
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肿瘤相关巨噬细胞来源的外泌体circPLK1促进非小细胞肺癌对EGFR抑制剂奥希替尼的耐药
Tumor-associated macrophages derived exosomal circPLK1 promotes resistance to EGFR inhibitor osimertinib in non-small cell lung cancer.
实验完整度
中包含细胞模型（THP-1极化、H1975共培养）的功能验证和机制验证（RIP、RNA pull-down），但缺乏动物模型或患者样本验证。
主要模型
THP-1细胞诱导的M2型巨噬细胞 H1975非小细胞肺癌细胞系
重点核对
THP-1细胞经50 ng/mL PMA诱导3小时，再用20 ng/mL IL-4和IL-13诱导24小时获得M2巨噬细胞 M2-Exo与H1975细胞共培养48小时，随后OSI处理48小时 circPLK1过表达质粒（Ex-circPLK1）和miR-186 mimic转染H1975细胞48小时 CCK-8实验检测细胞活力，OSI浓度0-640 nM 凋亡检测采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术
摘要
背景：环状RNA（circRNA）参与多种癌症的发生和发展。已有报道circRNA Polo样激酶1（PLK1）在非小细胞肺癌（NSCLC）中上调，但circPLK1在NSCLC中的机制仍有待进一步探索。方法：将THP-1细胞诱导为M2巨噬细胞极化，以获得M2巨噬细胞来源的外泌体（M2-Exo）。检测M2-Exo的摄取及其在奥希替尼（OSI）敏感性、凋亡和表皮生长因子受体（EGFR）激活中的作用。接下来，还检测了circPLK1的表达及其对上述指标的作用。通过CircInteractome预测circPLK1的靶标。最后，验证了circPLK1对miRNA和通路的调控作用。结果：M2巨噬细胞诱导NSCLC细胞对OSI耐药并减少凋亡。与M2和M2-Exo共培养后，H1975细胞中circPLK1上调。circPLK1过表达降低了NSCLC细胞对OSI的敏感性，抑制凋亡，并增加EGFR磷酸化。miR-186是circPLK1的靶标，其在M2-Exo和circPLK1过表达的NSCLC细胞中表达降低。此外，与M2-Exo共培养增加了NSCLC细胞中EGFR、AKT和细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化。miR-186模拟物降低了这些蛋白的磷酸化水平。在OSI处理的NSCLC细胞中，circPLK1过表达增加了EGFR、AKT和ERK的磷酸化。miR-186模拟物消除了circPLK1对这些蛋白的作用。结论：M2极化巨噬细胞来源的外泌体中的circPLK1促进NSCLC对OSI的耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- M2型巨噬细胞来源的外泌体circPLK1是否通过调控miR-186/PI3K/AKT通路促进非小细胞肺癌对奥希替尼的耐药？
- 核心机制
- M2巨噬细胞来源的外泌体将circPLK1转移至NSCLC细胞，circPLK1作为miR-186的海绵，上调SHP2表达，激活PI3K/AKT通路，导致OSI耐药。
- 主要证据
- 在H1975细胞中，M2-Exo或circPLK1过表达降低OSI敏感性、抑制凋亡、增加EGFR磷酸化，且miR-186 mimic逆转这些效应；RIP和RNA pull-down证实circPLK1与miR-186结合。
- 研究意义
- 该机制可能与NSCLC进展相关，为探索基于外泌体的治疗策略提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
M2巨噬细胞与NSCLC细胞共培养及功能检测
评估M2巨噬细胞对NSCLC细胞OSI敏感性和凋亡的影响。
将M2巨噬细胞与H1975细胞共培养，检测细胞活力、IC50和凋亡。
外泌体提取、鉴定及摄取
验证M2巨噬细胞来源的外泌体可被NSCLC细胞摄取。
从M2条件培养基中提取外泌体，通过电镜观察形态，Western blot检测标志物，PKH67标记外泌体并观察H1975细胞摄取。
M2-Exo对NSCLC细胞耐药性和EGFR激活的影响
验证M2-Exo对OSI耐药性和EGFR通路的作用。
用M2-CM或M2-Exo处理H1975细胞，检测细胞活力、IC50、凋亡和p-EGFR/EGFR水平。
circPLK1在巨噬细胞和NSCLC细胞间的转移
证明circPLK1通过M2-Exo从巨噬细胞转移至NSCLC细胞。
检测circPLK1在巨噬细胞、外泌体及共培养后的H1975细胞中的表达；用Cy3标记circPLK1转染M2巨噬细胞，提取外泌体与H1975共培养，FISH检测信号。
circPLK1对OSI耐药性和凋亡的影响
验证circPLK1过表达对NSCLC细胞OSI敏感性和凋亡的影响。
将circPLK1过表达质粒转染H1975细胞，检测细胞活力、IC50、凋亡和EGFR磷酸化。
circPLK1靶向miR-186的机制验证
验证circPLK1与miR-186的直接结合及其对下游信号通路的影响。
通过CircInteractome预测miR-186靶标，用RIP和RNA pull-down验证结合，检测miR-186表达及下游蛋白（p-EGFR、p-AKT、p-ERK、SHP2）水平，并观察miR-186 mimic的逆转作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| β-巯基乙醇 | 文中未明确说明 | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | 文中未明确说明 | -- | |
| M2极化 | 佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯 | MedChemExpress | -- |
| 白细胞介素-4 | 文中未明确说明 | -- | |
| 白细胞介素-13 | 文中未明确说明 | -- | |
| 药物处理 | 奥希替尼 | 文中未明确说明 | -- |
| 流式分析 | 抗CD80抗体 | Proteintech | 14292-1-AP |
| 抗CD206抗体 | Proteintech | 18704-1-AP | |
| 实时荧光定量PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 一步法PrimeScript cDNA合成试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | -- | |
| 7500 Quick Dx实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| RNase R处理 | 核糖核酸酶R | Guangzhou Geneseed Biotech. Co., Ltd. | R0301 |
| CCK-8实验 | CCK-8溶液 | 文中未明确说明 | -- |
| 酶标仪（ELX-800） | BIOTEK | ELX-800 | |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC结合液 | Bestbio | -- |
| 碘化丙啶染色液 | 文中未明确说明 | -- | |
| 外泌体分离与鉴定 | 外泌体提取和纯化试剂盒 | Umibio | -- |
| 外泌体浓缩液试剂 | Umibio | -- | |
| 外泌体纯化过滤器 | Umibio | -- | |
| 日立H-600透射电子显微镜 | Hitachi | H-600 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | 文中未明确说明 | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 抗p-EGFR抗体 | Abcam | ab40815 | |
| 抗EGFR抗体 | Abcam | ab32077 | |
| 抗SHP2抗体 | Abcam | ab32083 | |
| 抗CD36抗体 | Abcam | ab133625 | |
| 抗p-AKT抗体 | Proteintech | 28731-1-AP | |
| 抗AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| 抗CD9抗体 | Proteintech | 20597-1-AP | |
| 抗CD81抗体 | Proteintech | 27855-1-AP | |
| 抗p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4690 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 外泌体标记 | PKH67绿色荧光染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| ExoQuick-TC试剂 | 文中未明确说明 | -- | |
| DAPI | 文中未明确说明 | -- | |
| 荧光共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 细胞转染 | circPLK1过表达质粒 | RiboBio | -- |
| miR-186模拟物 | RiboBio | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FISH | Cy3标记的含circPLK1的pcDNA3.1载体 | RiboBio | -- |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗Ago2抗体 | 文中未明确说明 | -- | |
| 抗IgG抗体 | 文中未明确说明 | -- | |
| RNA pull-down | 生物素标记的miR-186探针 | GenePharma | -- |
| 对照探针 | GenePharma | -- | |
| 链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| M2巨噬细胞极化 | THP-1细胞用50 ng/mL PMA处理3小时，然后用20 ng/mL IL-4和IL-13处理24小时。 阅读提示：Materials and methods, M2 macrophage polarization |
| 共培养实验 | Transwell共培养48小时，H1975细胞与M2巨噬细胞共培养。 阅读提示：Materials and methods, Co-culture of H1975 with THP-1 |
| 外泌体处理 | M2-Exo与H1975细胞共培养48小时，然后OSI处理48小时。 阅读提示：Results, M2-exos induces osimertinib resistance in NSCLC cells, Figure 3 |
| circPLK1过表达 | circPLK1过表达质粒转染H1975细胞48小时，使用Lipofectamine 3000。 阅读提示：Materials and methods, Cell transfection |
| miR-186 mimic处理 | miR-186 mimic转染H1975细胞，使用Lipofectamine 3000，处理时间未明确说明，但通常为48小时。 阅读提示：Materials and methods, Cell transfection; Results, Figure 6G |