建立阿帕替尼耐药细胞系并验证耐药表型
获得阿帕替尼耐药胃癌细胞模型，并确认其对阿帕替尼的耐药性。
通过逐渐增加阿帕替尼浓度处理MGC803和AGS细胞，建立耐药细胞系MGC803/AR和AGS/AR；通过细胞活力实验和集落形成实验验证耐药性；在裸鼠中建立异种移植瘤模型评估体内耐药性。
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胆固醇赋予胃癌对阿帕替尼介导的铁死亡抵抗性
Cholesterol confers resistance to Apatinib-mediated ferroptosis in gastric cancer.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（耐药细胞系、功能验证、机制研究）和体内动物实验（异种移植瘤模型），并进行了分子机制（EHF调控HMGCR）的验证。
主要模型
MGC803/AR和AGS/AR阿帕替尼耐药胃癌细胞系 MGC803/WT和AGS/WT亲本胃癌细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型（AGS/AR和MGC803/AR）
重点核对
阿帕替尼耐药细胞系MGC803/AR和AGS/AR的建立及耐药表型验证 胆固醇合成通路（HMGCR）的转录组和蛋白表达变化 辛伐他汀处理浓度（5 μM）及处理时间（48小时） 体内实验中辛伐他汀给药剂量（10 mg/kg，腹腔注射，每3天一次）和阿帕替尼给药剂量（50 mg/kg，口服，每日一次） 铁死亡相关指标检测（脂质ROS、GSH、MDA、亚铁离子）
摘要
背景：胃癌是全球癌症相关死亡的第五大原因。阿帕替尼是胃癌的三线治疗药物。然而，耐药性的发展显著限制了其疗效，而克服阿帕替尼耐药性的有效且安全的策略仍然难以捉摸。结果：我们发现阿帕替尼耐药的胃癌细胞（MGC803/AR和AGS/AR）表现出胆固醇合成增加和细胞内胆固醇水平升高，这导致了阿帕替尼耐药性。进一步研究确定3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）是胆固醇合成通路中上调最显著的基因之一。抑制HMGCR不仅抑制了耐药细胞的增殖、迁移和侵袭，还降低了它们对阿帕替尼的耐药性。此外，辛伐他汀（一种HMGCR抑制剂）有效地使耐药细胞对阿帕替尼诱导的铁死亡重新敏感，从而在体外和体内增强了阿帕替尼的治疗效果。结论：这些发现表明，辛伐他汀可能作为克服胃癌阿帕替尼耐药性的一种新颖且安全的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 阿帕替尼耐药性产生的分子机制，以及如何安全有效地克服胃癌中的阿帕替尼耐药性。
- 核心机制
- 阿帕替尼耐药胃癌细胞中转录因子EHF上调HMGCR表达，促进胆固醇合成，增加脂筏水平，从而保护细胞免受阿帕替尼诱导的铁死亡。
- 主要证据
- 通过RNA-seq和GSEA发现胆固醇合成通路富集，耐药细胞中HMGCR高表达；HMGCR敲低或辛伐他汀抑制HMGCR可增强阿帕替尼诱导的铁死亡（如脂质ROS升高、GSH降低）；EHF通过结合HMGCR启动子促进其转录，双荧光素酶和ChIP实验验证。
- 研究意义
- 辛伐他汀联合阿帕替尼可能作为克服胃癌阿帕替尼耐药性的安全有效策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析筛选胆固醇合成通路
鉴定与阿帕替尼耐药相关的信号通路和关键基因。
对AGS/AR和AGS/WT细胞进行RNA-seq，使用GSEA分析REACTOME和WikiPathway基因集，发现胆固醇合成通路富集；利用qPCR验证胆固醇合成相关基因表达。
验证胆固醇在阿帕替尼耐药中的作用
确认细胞内胆固醇水平升高是否导致阿帕替尼耐药。
通过胆固醇补充或MβCD耗竭胆固醇，检测细胞对阿帕替尼的敏感性变化；使用Filipin染色和胆固醇测定试剂盒检测细胞内胆固醇水平。
评估HMGCR在耐药和恶性表型中的功能
确定HMGCR是否介导胆固醇合成和阿帕替尼耐药。
通过siRNA或shRNA敲低HMGCR，或过表达HMGCR，检测细胞增殖、迁移、侵袭和对阿帕替尼的敏感性；检测胆固醇水平变化以及胆固醇补充的挽救效果。
验证辛伐他汀抑制HMGCR并恢复阿帕替尼敏感性
评估辛伐他汀能否通过抑制HMGCR克服阿帕替尼耐药。
使用辛伐他汀处理耐药细胞，检测胆固醇水平、细胞活力、集落形成；与阿帕替尼联用观察效果，并用胆固醇补充验证机制特异性。
检测铁死亡相关指标及辛伐他汀的增敏作用
阐明辛伐他汀增强阿帕替尼诱导铁死亡的机制。
检测脂质ROS、ROS、GSH、MDA、亚铁离子和脂筏水平，比较辛伐他汀或HMGCR敲低后的变化，并使用胆固醇或Ferrostatin-1进行挽救。
鉴定EHF作为HMGCR的转录调控因子
探究HMGCR上调的转录调控机制。
通过生物信息学预测和实验验证EHF结合HMGCR启动子并促进其转录；使用siRNA敲低EHF检测细胞对阿帕替尼和铁死亡的敏感性。
评估辛伐他汀联合阿帕替尼的体内抗肿瘤效果
验证辛伐他汀联合阿帕替尼在体内是否克服耐药并评估安全性。
使用MGC803/AR细胞建立裸鼠移植瘤模型，分组治疗，测量肿瘤体积和重量，进行Ki67免疫组化和H&E染色评估毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应或铁死亡
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Procell | 164210-50 | |
| 青霉素-链霉素 | OriCell | ATPS-10001-100 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026CN |
| cDNA合成 | SweScript RT II第一链cDNA合成试剂盒（含gDNA去除剂） | Servicebio | G3333 |
| qRT-PCR | 2×Universal Blue SYBR Green qPCR预混液 | Servicebio | G3326 |
| 7500实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 胆固醇检测 | 菲律宾霉素复合物 | MedChemExpress | HY-N6716 |
| 组织总胆固醇检测试剂盒 | Applygen | E1015 | |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD Biosciences | 356237 |
| 细胞活力检测 | CCK8试剂盒 | Glpbio | GK10001 |
| 药物处理 | 胆固醇（水溶性） | MedChemExpress | HY-N0322A |
| 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | MedChemExpress | HY-130462 | |
| 甲基-β-环糊精 | MedChemExpress | HY-101461 | |
| 辛伐他汀 | MedChemExpress | HY-17502 | |
| RSL3 | MedChemExpress | HY-100218 | |
| 奥沙利铂 | MedChemExpress | HY-17371 | |
| 5-氟尿嘧啶 | MedChemExpress | HY-90006 | |
| 脂质ROS检测 | BODIPY™ 581/591 C11荧光探针 | Invitrogen | D3861 |
| ROS检测 | 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | MedChemExpress | HY-D0940 |
| 流式分析 | Attune NxT流式细胞仪 | Invitrogen | -- |
| 成像 | 共聚焦激光扫描显微镜（Nikon A1 LFOV） | Nikon | -- |
| GSH检测 | 还原型谷胱甘肽含量检测试剂盒 | Solarbio | BC1175 |
| MDA检测 | 丙二醛比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K028-M |
| 亚铁离子检测 | 细胞亚铁离子比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K881-M |
| 脂筏检测 | 人Flotillin-1 ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-EL008727HU |
| siRNA转染 | Lipo8000™转染试剂 | Beyotime | C0533FT |
| ChIP实验 | BeyoChIP™酶法染色质免疫沉淀测定试剂盒 | Beyotime | P2083S |
| EHF抗体 | Proteintech | 27195-1-AP | |
| IgG抗体 | Proteintech | 30000-0-AP | |
| 双荧光素酶实验 | pEZX-FR01质粒 | GeneCopoeia | ZX001 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | GeneCopoeia | LF004 | |
| Western blot | HMGCR抗体 | ABclonal | A16875 |
| EHF抗体 | Proteintech | 27195-1-AP | |
| SREBP2抗体 | UpingBio | YP-Ab-04920 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Abmart | M21002 | |
| ECL化学发光底物 | Biosharp | BL523A | |
| Western blot成像 | GeneGnome XRQ凝胶成像系统 | SYNGENE | -- |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | 广东智源生物 | -- |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Proteintech | 27309-1-AP |
| 二抗 (PV-6001) | zsgbbio | PV-6001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞系建立 | 阿帕替尼浓度递增方案、维持浓度50 μM、耐药表型稳定性 阅读提示：参见Methods中Cell culture部分 |
| 细胞培养与处理 | 培养基、FBS浓度、抗生素、培养条件；药物浓度和处理时间（如阿帕替尼、辛伐他汀、RSL3等） 阅读提示：参见Methods中Cell culture、Cell viability assay部分 |
| 胆固醇检测 | Filipin染色浓度（0.05 mg/mL）和处理时间（2小时）、胆固醇测定试剂盒操作步骤 阅读提示：参见Methods中Intracellular cholesterol measurement部分 |
| HMGCR敲低/过表达 | siRNA序列、转染试剂及浓度（50 nM）、慢病毒构建、嘌呤霉素筛选浓度（4 µg/mL） 阅读提示：参见Methods中Gene knockdown using SiRNA、Construction of stably knockdown/overexpression cell lines部分 |
| 铁死亡检测 | BODIPY C11和H2DCFDA浓度（10 μM）、孵育时间（30分钟）、GSH/MDA/亚铁离子试剂盒型号、脂筏检测试剂盒 阅读提示：参见Methods中Lipid ROS and intracellular ROS assay、GSH, MDA, ferrous iron and lipid raft assay部分 |
| 体外药物处理 | Apatinib浓度范围（1-100 μM）、辛伐他汀浓度（2-5 μM）、胆固醇浓度（5 mg/ml）、MβCD浓度（3 mM）及处理时间 阅读提示：参见Methods中Cell viability assay、Colony-formation assay部分 |
| 体内实验 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞接种量（5×10^6）、分组、给药剂量和途径（辛伐他汀10 mg/kg腹腔注射每3天；阿帕替尼50 mg/kg口服每日）、治疗周期（15天） 阅读提示：参见Methods中In vivo experiment部分及Fig. 8A |