肠道菌群组成及功能分析
比较AS小鼠与正常小鼠肠道菌群的多样性、组成和功能差异，探究肠道菌群在AS中的作用。
对6只AS模型小鼠和6只正常小鼠的粪便样本进行16S rRNA测序，进行α/β多样性分析、物种组成分析、LEfSe差异分析及KEGG功能预测。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肠道微生物来源的三甲胺-N-氧化物抑制SIRT1以调节SM22α介导的平滑肌细胞炎症并促进动脉粥样硬化进展
Gut microbiota-derived trimethylamine-N-oxide inhibits SIRT1 to regulate SM22α-mediated smooth muscle cell inflammation and promote atherosclerosis progression.
实验完整度
高研究包含16S rRNA测序、代谢组学、转录组学等多组学分析，并采用细胞实验（VSMCs、BMDMs）、动物模型（ApoE−/−小鼠）及FMT功能性验证，且明确功能与机制验证。
主要模型
小鼠血管平滑肌细胞（VSMCs） 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） ApoE−/−小鼠动脉粥样硬化模型 SIRT1敲入ApoE−/−小鼠
重点核对
TMAO处理VSMCs的浓度（0-900 μmol/L）及时间（0-24 h） Sirt1敲低/过表达及SM22α过表达对VSMCs功能的影响 FMT实验的抗生素预处理及菌群移植方案 ApoE−/−小鼠高脂饮食诱导的AS模型及Sirt1敲入模型 Western blot及RT-qPCR检测的蛋白和mRNA表达变化
摘要
动脉粥样硬化(AS)是一种常见的心血管疾病，新兴证据强调肠道微生物在其发展中的关键作用。三甲胺-N-氧化物(TMAO)是一种源自肠道微生物的代谢物，被认为通过调节血管平滑肌细胞中平滑肌蛋白22-α(SM22α)介导的炎症来促进AS进展。本研究旨在通过多组学分析探讨TMAO在AS中的分子机制，特别是其对SIRT1抑制和SM22α调节的作用。16S核糖体RNA测序揭示AS小鼠肠道微生物组成改变，以拟杆菌属增加和厚壁菌门减少为特征。代谢组学分析显示AS小鼠中TMAO水平升高。转录组数据和细胞实验进一步证实TMAO通过调节SIRT1调节SM22α介导的炎症促进AS。这些发现表明TMAO通过SIRT1和SM22α相关通路加速进展，为AS干预提供新的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道微生物代谢物TMAO如何通过SIRT1和SM22α调节平滑肌细胞炎症并促进动脉粥样硬化进展？
- 核心机制
- TMAO抑制SIRT1表达，导致SM22α下调，进而通过NF-κB信号通路促进平滑肌细胞炎症，加速AS进展。
- 主要证据
- 多组学分析（16S rRNA、代谢组学、转录组学）结合细胞实验（VSMCs、BMDMs）和动物模型（ApoE−/−小鼠，Sirt1敲入小鼠）验证了TMAO通过SIRT1-SM22α-NF-κB轴促进炎症。
- 研究意义
- 研究为理解肠道微生物与心血管病理之间的机制联系提供了新见解，并为靶向TMAO或其上游代谢途径的AS干预策略奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代谢组学分析及TMAO水平检测
鉴定AS小鼠与正常小鼠差异代谢物，并验证TMAO水平的改变。
对小鼠粪便进行LC-MS非靶向代谢组学分析，鉴定差异代谢物；利用GC-MS检测血清中TMA和TMAO水平。
FMT实验验证肠道菌群对AS的影响
通过粪菌移植验证肠道菌群是否通过调节TMAO水平影响AS进展。
对AS小鼠进行抗生素清除肠道菌群后，通过口服灌胃正常小鼠粪便滤液或载体对照，检测血清TMAO、炎症因子、血脂、氧化应激及主动脉斑块变化。
转录组学分析及关键基因筛选
识别TMAO影响AS进展的关键靶基因。
下载GEO转录组数据集GSE100927（24例AS和24例对照），进行差异表达分析；对AS小鼠FMT治疗后动脉组织进行RNA-seq，结合WGCNA和TMAO靶基因数据库（gutMGene）交叉分析，确定Sirt1为关键基因。
细胞实验验证TMAO对VSMCs功能的影响
验证TMAO对血管平滑肌细胞增殖、黏附及炎症反应的直接作用。
使用原代小鼠VSMCs，经不同浓度TMAO处理，检测细胞活力（MTT）、增殖（EdU、克隆形成）、黏附（与BMDM共培养）及炎症因子表达（ELISA）。
验证Sirt1在TMAO诱导的VSMC功能变化中的作用
探究Sirt1表达改变对TMAO诱导的VSMC增殖、黏附及炎症的影响。
通过siRNA敲低或过表达Sirt1，在TMAO刺激下，检测VCAM-1表达、细胞增殖、黏附及炎症因子mRNA水平。
机制验证：Sirt1通过SM22α调控NF-κB通路
阐明Sirt1调控VSMC炎症的下游机制，即通过SM22α和NF-κB通路。
在VSMCs中敲低Sirt1或SM22α，或过表达Sirt1/SM22α，检测SM22α、MYH11、IκBα、NF-κB及VCAM-1表达，以及炎症因子水平。
动物水平验证Sirt1过表达对AS的影响
在体内验证Sirt1过表达能否抑制AS进展和炎症。
使用Sirt1敲入ApoE−/−小鼠，高脂饮食12周后，评估体重变化、血脂、氧化应激、主动脉斑块面积、巨噬细胞浸润及炎症因子水平，并检测主动脉组织中相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| Trizol试剂 | Invitrogen | 10296010 | |
| RNA质量检测 | Nanodrop 2000分光光度计 | Nanodrop | 1011U |
| RNA-seq文库构建 | Ribo-Zero™磁珠试剂盒 | Epicenter Technologies | MRZE706 |
| NEB Next Ultra RNA文库制备试剂盒 | NEB | #E7775 | |
| USER酶 | NEB | #M5508 | |
| RNA-seq文库定量 | KAPA文库定量试剂盒 | KAPA Biosystems | KK4844 |
| RNA-seq测序 | NextSeqCN500测序仪 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | 胶原酶溶液 | Thermo Gibco | 17104019 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | |
| Heracell™ Vios 160i CO2培养箱 | Thermo Scientific™ | 51033770 | |
| 细胞鉴定 | α-SMA抗体 | Abcam | ab7817 |
| 细胞感染 | 聚凝胺 | Merck | TR-1003 |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | A1113803 | |
| 重组慢病毒 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- |
| 支原体检测 | 支原体检测试剂盒 | Beyotime | C0301S |
| 细胞黏附实验 | BCECF-AM荧光探针 | Beyotime | S1006 |
| EdU检测 | EdU溶液 | Thermo Fisher | C10418 |
| Western blot | 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T4799-5G |
| RIPA裂解液 | Wuhan Bosideng Co., Ltd. | AR0108 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Wuhan Bosideng Co., Ltd. | AR1189 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| 抗小鼠HRP二抗 | CST | 7076 | |
| ECL工作液 | Beijing Aomijiade Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | Omt-01 | |
| LC-MS分析 | ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱 | Waters | -- |
| GC-MS分析 | 去活键合聚乙二醇蜡柱 | Agilent | -- |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab197742 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Abcam | ab208348 | |
| ELISA试剂盒 | Abcam | ab171523 | |
| 血脂检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | Solarbio | BC0625 |
| 氧化应激检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Solarbio | BC0025 |
| 血脂检测 | 无抗凝剂采血管 | Solarbio | YA1461 |
| 氧化应激检测 | EDTA抗凝管 | Solarbio | YA1461 |
| 血脂检测 | TG含量检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 氧化应激检测 | 微量MDA检测试剂盒 | -- | -- |
| 油红O染色 | 油红O溶液 | -- | -- |
| OCT包埋剂 | -- | -- | |
| 光学显微镜 | Olympus | CX43 | |
| FMT | 万古霉素 | -- | -- |
| 新霉素 | -- | -- | |
| 甲硝唑 | -- | -- | |
| 两性霉素B | -- | -- | |
| MTT检测 | 噻唑蓝 | Sigma-Aldrich | 298-93-1 |
| RT-qPCR | PrimeScript™ RT-qPCR试剂盒 | TaKaRa | RR086A |
| SYBR Premix Ex Taq™ | TaKaRa | DRR820A | |
| LightCycler 480系统 | Roche Diagnostics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肠道菌群分析 | 样本量（KO和WT各6只），数据分析软件参数（如LDA阈值），以及参考数据库版本 阅读提示：Methods 2.1-2.3，以及Figure 1和2的图注 |
| 代谢组学分析 | LC-MS和GC-MS的具体参数（如流动相梯度、电离电压），样本处理细节（如甲醇/甲酸比例） 阅读提示：Methods 2.15和2.16，及Figure 4的图注 |
| FMT实验 | 抗生素混合物种类和剂量，FMT频率和时长，对照组处理 阅读提示：Methods 2.20，及Figure 5的图注 |
| 转录组学分析 | GEO数据集GSE100927样本数量和类型，差异基因筛选阈值，WGCNA参数 阅读提示：Methods 2.4, 2.8, 2.9，及Figure 6的图注 |
| VSMCs培养及处理 | VSMCs分离步骤，TMAO处理浓度和时间，细胞培养条件 阅读提示：Methods 2.10，及Figure 7的图注 |
| 细胞感染 | 慢病毒MOI和滴度，polybrene浓度，筛选抗生素浓度 阅读提示：Methods 2.11 |
| Sirt1功能验证 | siSirt1和Sirt1 OE转染效率，TMAO刺激浓度和时间，检测方法 阅读提示：Methods 2.11和2.13，及Figure 8的图注 |
| 机制验证 | siSM22α和SM22α OE的浓度和转染条件，NF-κB通路蛋白检测 阅读提示：Methods 2.11和2.14，及Figure 9的图注 |
| 动物实验 | 小鼠品系、年龄、性别、体重，高脂饮食成分和喂养周期，Sirt1敲入构建方法 阅读提示：Methods 2.5，及Figure 10的图注 |