单细胞和空间转录组图谱构建
描绘PitNETs的细胞组成和空间结构，识别肿瘤细胞和微环境细胞类型。
对57个垂体组织样本进行单细胞RNA测序和空间转录组学，识别主要细胞群和空间生态位。
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单细胞和空间转录组分析揭示参与垂体神经内分泌肿瘤进展的肿瘤异质性和免疫重塑
Single-cell and spatial transcriptome analyses reveal tumor heterogeneity and immune remodeling involved in pituitary neuroendocrine tumor progression.
实验完整度
高整合单细胞RNA测序和空间转录组学，结合体内外实验（细胞系、原代细胞、类器官）及多重免疫荧光验证，并包含功能实验（增殖、迁移、侵袭）和机制验证（ITGB1敲低）。
主要模型
GH3细胞系 AtT-20细胞系 TtT/GF细胞系 患者来源的原代垂体肿瘤细胞和类器官
重点核对
细胞系GH3、AtT-20、TtT/GF的ITGB1敲低效率 OPN处理浓度（1或5 μg/ml）和时间（24小时） PitNET类器官培养条件（基质胶、生长因子） 患者样本的侵袭性定义（Knosp分级、Trouillas分类）
摘要
垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）可能是侵袭性或侵袭性的，然而这些行为背后的机制仍然知之甚少，阻碍了治疗进展。在这里，我们整合了单细胞RNA测序和空间转录组学，分析了来自57个组织样本的超过177,000个细胞和35,000个斑点。这种全面的方法有助于识别PitNETs肿瘤群体，并表征了随着PitNETs进展和侵袭的肿瘤微环境（TME）的重构。我们追踪了TPIT谱系PitNETs的轨迹，并识别出一个以p53介导的增殖升高和更高的Trouillas分级为标志的侵袭性肿瘤簇，这两者都与肿瘤进展相关。此外，我们记录了PitNETs内免疫基质细胞的异质性，特别注意到SPP1+肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在侵袭性肿瘤中的富集。这些TAMs通过SPP1-ITGAV/ITGB1信号通路促进肿瘤侵袭。我们对PitNETs的深入单细胞和空间分析揭示了TME内的分子动力学，提示了治疗干预的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 垂体神经内分泌肿瘤侵袭性和侵袭性的机制尚不清楚，本研究旨在通过单细胞和空间转录组学揭示肿瘤异质性和肿瘤微环境重组，并寻找潜在治疗靶点。
- 核心机制
- SPP1+肿瘤相关巨噬细胞通过SPP1-ITGAV/ITGB1配体-受体相互作用促进肿瘤侵袭，激活MAPK和PI3K-AKT通路；同时，TPIT谱系中ACTHAgg亚群通过p53信号通路驱动肿瘤增殖。
- 主要证据
- 基于177,000余个细胞的单细胞测序和35,000余个斑点的空间转录组学，结合体外细胞系（GH3、AtT-20、TtT/GF）功能实验和患者来源类器官实验，以及多重免疫荧光和独立队列验证。
- 研究意义
- 本研究为理解PitNETs的生物学提供了更精细的认识，并可能为针对SPP1+ TAMs或p53通路的靶向治疗策略奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肿瘤细胞异质性分析
揭示不同PitNETs谱系内的肿瘤细胞亚群及其转录特征。
对肿瘤细胞进行无监督聚类，鉴定各谱系亚群，包括增殖、侵袭、干细胞样等状态。
TPIT谱系肿瘤进展轨迹和侵袭性亚群鉴定
追踪TPIT谱系肿瘤细胞分化轨迹，鉴定与侵袭性相关的细胞亚群和关键标志物。
用Monocle2进行轨迹分析，结合临床病理特征和全外显子测序，鉴定ACTHAgg亚群。
肿瘤免疫微环境分析
表征免疫和基质细胞亚群，特别是肿瘤相关巨噬细胞的异质性。
对免疫基质细胞进行聚类，鉴定SPP1+ TAM等亚群，并分析其空间分布和与CAF的共定位。
SPP1+ TAM与肿瘤侵袭的关联验证
验证SPP1+ TAM在肿瘤侵袭中的作用及其分子机制。
结合空间转录组、多重免疫荧光、体外细胞系实验（增殖、迁移、侵袭）、类器官模型和ITGB1敲低实验，验证SPP1-ITGAV/ITGB1通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 10x Chromium单细胞3'试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| 空间转录组测序 | Visium空间基因表达试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| Leica Aperio Versa 8 | Leica | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ThermoFisher | 11995065 |
| DMEM/F12培养基 | Procell | CM-0561 | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | 10270106 | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher | 15070063 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | LABLEAD | CK001 |
| 酶标仪 | Agilent Technologies | BioTek | |
| 细胞处理 | 骨桥蛋白 | MedChemExpress | HY-P79222 |
| 骨桥蛋白 | bioswamp | RPH01180 | |
| Transwell侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | CLS3422 |
| 基质胶 | Servicebio | G4131-5ML | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 原代细胞处理 | IV型胶原酶 | Solarbio | C8160 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Solarbio | D8071 | |
| 重组人骨桥蛋白 | Novoprotein | C544 | |
| 类器官培养 | 基质胶 | R&D Systems | 3533-010-02 |
| 高级DMEM/F-12培养基 | ThermoFisher | 12634010 | |
| B27添加剂 | Biosharp | BL319A | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Innochem | A30872 | |
| 表皮生长因子 | MedChemExpress | HY-P7109 | |
| 胰岛素样生长因子1 | Solarbio | P00049 | |
| 头蛋白 | GenScript | Z03380 | |
| 成纤维细胞生长因子8 | GenScript | Z02989 | |
| Y-27632 | MACKLIN | Y833107 | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | Shanghai yuanye Bio-Technology | S24025 | |
| 促甲状腺激素释放激素 | TargetMol | T7407 | |
| 类器官活力测定 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| 免疫荧光 | SF1抗体 | Genetech | GT231702 |
| FSH抗体 | MXB | MAB-0782 | |
| 突触素抗体 | ZSGB-BIO | ZM-0246 | |
| DAPI | Solarbio | C0060 | |
| 二抗 | Proteintech | SA00013-2 | |
| 免疫组化 | p53抗体 | Abcam | -- |
| Ki67抗体 | ZSGB | ZM-0166 | |
| 多重免疫荧光 | CD68抗体 | abcarta | PA014 |
| SPP1抗体 | Abcam | ab214050 | |
| αSMA抗体 | CST | 19245S | |
| ITGAV抗体 | Beyotime | AF7308 | |
| ITGB1抗体 | Elabscience | E-AB-10403 | |
| FN1抗体 | SAB | 40932 | |
| MYL9抗体 | Elabscience | E-AB-12582 | |
| ADCYAP1抗体 | FineTest | FNab10094 | |
| ANXA1抗体 | Beyotime | AF5114 | |
| ASPM抗体 | biodragon | BDPN1665 | |
| BRCA2抗体 | Elabscience | E-AB-40288 | |
| CASC5抗体 | bioswamp | PAB31361 | |
| PENK抗体 | biodragon | BD-PT5829 | |
| ACTH抗体 | ZSGB | ZM-0004 | |
| PIT-1抗体 | ZSGB | ZM-0208 | |
| TPIT抗体 | ZSGB | ZM-0318 | |
| 抗原修复液 | abcarta | PS900(EDTA) | |
| 封闭液 | Abcepta | ABT00037 | |
| 荧光标记二抗 | Abcepta | ABT00041 | |
| 含DAPI抗淬灭封片剂 | Abcam | ab104139 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| ITGB1抗体 | Abcam | ab179471 | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| ECL检测系统 | Bio-Rad | Chemidoc | |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 慢病毒感染 | 嘌呤霉素 | MCE | HY-K1057 |
| 细胞培养 | AtT-20细胞系 | ATCC | CRL-1795 |
| GH3细胞系 | ATCC | CCL-82.1 | |
| TtT/GF细胞系 | Procell | CL-0561 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、血清浓度、生长因子 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 体外细胞处理 | OPN浓度（5 μg/ml）、处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Cell viability assay, Scratch assay, Transwell assay |
| 原代细胞分离 | 胶原酶IV浓度（1 mg/ml）、DNase I浓度（0.1 mg/ml）、消化时间（30分钟） 阅读提示：Methods: Transwell assay for human primary pituitary tumor cells |
| 类器官培养 | 基质胶、生长因子组合（EGF、IGF-1、Noggin等）、培养时间（15天） 阅读提示：Methods: Human pituitary tumor organoid culture, Cell viability assay for organoid |
| ITGB1敲低 | shRNA序列、慢病毒滴度、嘌呤霉素筛选浓度（4 μg/ml）、敲低效率验证 阅读提示：Methods: Plasmid construction, Lentivirus production, Establishment of ITGB1 Knockdown Cell Lines |
| 统计与可重复性 | 样本量、重复数、统计检验方法 阅读提示：Methods: Statistics and reproducibility |