构建和验证CCDI模型
基于多个PCD相关基因构建预测生存和免疫治疗反应的多基因签名。
利用TCGA-LUAD队列作为训练集，通过单因素和多因素Cox回归分析建立18种PCD各自的预后模型，并选择AUC>0.7的五个模型进行组合，最终确定ACD和necroptosis组合的CCDI最优。使用时间依赖性ROC曲线、Kaplan-Meier曲线和UMAP验证其性能，并在多个独立数据集中验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
整合批量、单细胞和空间转录组学以识别并功能验证增强非小细胞肺癌免疫治疗的新型靶点
Integrating bulk, single-cell, and spatial transcriptomics to identify and functionally validate novel targets to enhance immunotherapy in NSCLC.
实验完整度
高包含多个独立证据层级：多组学数据建模与验证、单细胞和空间转录组分析、体外功能实验、临床样本验证以及小鼠体内模型验证。
主要模型
NSCLC细胞系（A549、H1299等） LLC1同基因小鼠肺癌模型 TCGA-LUAD队列（n=569） NSCLC患者肿瘤及配对正常组织
重点核对
TCGA-LUAD队列作为训练集，cutoff值通过最小P值法确定（>0.34为高风险） 体外实验中CTSH过表达和PTGES3敲低在H1299和A549细胞中验证 体内实验中C57BL/6小鼠皮下注射1×10^6个LLC1细胞，抗PD-1抗体处理剂量为10mg/kg，每周三次 坏死性凋亡抑制剂NSA（15μM）和RIPA-56（1.0μM）处理24小时用于验证坏死性凋亡机制
摘要
程序性细胞死亡（PCD）对肿瘤进展至关重要。通过分析18种PCD，我们生成了一个稳健的多基因特征，即联合细胞死亡指数（CCDI），包含坏死性凋亡和自噬基因，用于非小细胞肺癌（NSCLC）。CCDI能准确根据生存预后对患者进行分层，并预测免疫治疗反应。我们使用5个单细胞RNA测序和2个空间转录组数据集验证了CCDI并优先排序了CCDI基因。CCDI与肿瘤恶性程度、侵袭性和免疫治疗抵抗呈正相关。四个坏死性凋亡基因（PTGES3、MYO6、CCT6A和CTSH）可能影响癌细胞进化。在体外，CTSH过表达或PTGES3敲低抑制NSCLC细胞增殖和迁移，同时诱导坏死性凋亡并形成坏死体。此外，我们在12对NSCLC肿瘤和正常组织中观察到CTSH减少、PTGES3升高和坏死性凋亡活性低。在同基因小鼠模型中，CTSH过表达或PTGES3敲低诱导坏死性凋亡并提高抗PD1治疗效率。这些发现表明坏死性凋亡基因是癌症治疗中的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 构建一个整合多种程序性细胞死亡模式的多基因签名（CCDI）以预测NSCLC患者的预后和免疫治疗反应，并识别和验证关键靶基因（CTSH和PTGES3）的功能及机制。
- 核心机制
- CTSH过表达或PTGES3敲低通过激活RIPK1/RIPK3/MLKL坏死性凋亡通路，促进坏死体形成，诱导坏死性凋亡，从而抑制肿瘤生长并增强抗PD-1治疗的效果。
- 主要证据
- 体外实验中CTSH过表达或PTGES3敲低抑制细胞增殖和迁移，诱导坏死性凋亡（LDH释放、RIPK1-RIPK3复合物形成）；体内实验中过表达Ctsh或敲低Ptges3的LLC1肿瘤生长减慢，并增加CD8+和CD4+ T细胞浸润，减少FOXP3+调节性T细胞，联合PD-1抗体进一步改善疗效。
- 研究意义
- 本研究表明坏死性凋亡基因（特别是CTSH和PTGES3）是NSCLC的潜在治疗靶点，为免疫治疗联合策略提供了新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预测免疫治疗反应
验证CCDI能否预测免疫检查点抑制剂（ICI）的治疗反应。
通过IPS、ImmuCellAI、SubMap等方法评估CCDI与预测免疫治疗反应的相关性，并在七个ICI临床试验数据集中验证CCDI区分应答者与非应答者的能力。
单细胞水平分析CCDI与肿瘤恶性程度的关系
探究CCDI在肿瘤细胞亚群中的表达变化及其与肿瘤进展的关系。
使用多个scRNA-seq数据集（如Philip Bischoff研究、GSE131907等），通过CopyKAT区分恶性细胞，聚类为不同亚群，利用GSVA和Slingshot轨迹分析CCDI基因的动态表达变化。
空间转录组分析CCDI的空间分布
验证CCDI基因在组织原位表达与肿瘤侵袭进展的关系。
对同一组织来源的scRNA-seq和Visium空间转录组数据（GSE189357和GSE189487）进行分析，将细胞类型映射到组织位置，观察CCDI和关键基因（如PTGES3、CTSH）在肿瘤结构中的表达变化。
体外功能验证CTSH和PTGES3
确定CTSH和PTGES3对NSCLC细胞增殖、迁移和坏死性凋亡的功能影响。
在NSCLC细胞系（如A549、H1299）中过表达CTSH或敲低PTGES3，检测细胞增殖（CCK-8）、迁移（Transwell和伤口愈合）、细胞膜损伤（LDH释放）和坏死性凋亡标志物（Western blot），并通过Co-IP验证坏死体形成。使用坏死性凋亡抑制剂（NSA和RIPA-56）进行反向验证。
临床样本验证
在患者肿瘤组织中验证CTSH和PTGES3的表达及坏死性凋亡活性。
通过Western blot和qRT-PCR检测12对NSCLC肿瘤及邻近正常组织中CTSH、PTGES3、RIPK3和MLKL的表达，并进行相关性分析。
体内验证CTSH和PTGES3对肿瘤生长和免疫治疗的影响
评估在体内过表达Ctsh或敲低Ptges3对肿瘤生长和抗PD-1疗效的影响。
将基因操作后的LLC1细胞皮下接种至C57BL/6小鼠，建立同基因模型。给予抗PD-1抗体或IgG对照，测量肿瘤体积和重量，并通过Western blot检测坏死性凋亡标志物，用免疫组化分析免疫细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Procell | PM150210 |
| RPMI-1640培养基 | Procell | PM150110 | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Procell | PB180120 | |
| RIPA-56 | MedChemExpress | HY-101032 | |
| 坏死磺酰胺（NSA） | MedChemExpress | HY-100573 | |
| 基因操作 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus Transfection | 101000027 |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NanoDrop1000分光光度计 | NanoDrop | -- | |
| SureScript第一链cDNA合成试剂盒 | Genecopoeia | -- | |
| BeyoFast SYBR Green qPCR预混液 | Beyotime | -- | |
| qTOWER 3实时PCR热循环仪 | Analytik | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012S | |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Epizyme Biotech | PG112 | |
| CTSH抗体 | Proteintech | 10315-1-AP | |
| PTGES3抗体 | Proteintech | 15216-1-AP | |
| MLKL抗体 | Zen Biotechnology | 380559 | |
| 磷酸化MLKL (Ser358)抗体 | Zen Biotechnology | 382136 | |
| RIPK3抗体 | Affinity Biosciences | AF4808 | |
| 磷酸化RIPK3抗体 | Cell Signaling Technology | 93654 | |
| RIPK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3493 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| HRP标记二抗 | Proteintech | SA00001-1/SA00001-2 | |
| Co-IP | 免疫沉淀裂解液 | Beyotime | P0013 |
| PMSF蛋白酶抑制剂 | Beyotime | ST505 | |
| 增殖和迁移实验 | 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | GlpBio | GK10001 |
| 96孔板 | Corning | 3599 | |
| 8μm Transwell小室 | Corning | 3422 | |
| LDH释放检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | C0016 |
| 体内实验 | 小鼠抗PD-1抗体 | BioXcell | BE0146 |
| IgG | Beyotime | A7050 | |
| 免疫组化 | 抗CK抗体 | Proteintech | 10164-2-AP |
| 抗NK抗体 | Beyotime | AG2387 | |
| 抗CD11B抗体 | Beyotime | AF6396 | |
| 抗CD3抗体 | Proteintech | 17617-1-AP | |
| 抗CD4抗体 | Beyotime | AG1393 | |
| 抗CD8抗体 | Beyotime | AG1411 | |
| 抗FOXP3抗体 | Proteintech | 22228-1-AP | |
| HRP标记二抗 | Proteintech | RGAR011 | |
| DAB显色剂 | Novus Biologicals | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 模型构建 | TCGA-LUAD队列作为训练集，cutoff值（>0.34高风险），纳入基因（9个ACD基因和11个necroptosis基因） 阅读提示：Methods: Construction and validation of the CCDI model |
| 细胞培养 | 细胞系（BEAS-2B、A549、H1299等）来源和培养条件（DMEM/RPMI-1640，10% FBS，1%双抗） 阅读提示：Methods: Cell culture and reagents |
| 体外基因操作 | CTSH过表达质粒、PTGES3 shRNA序列和转染试剂（jetPRIME）浓度50nM，转染时间和检测时间（24h） 阅读提示：Methods: Lentivirus infection and plasmid transfection |
| 体外功能检测 | CCK-8检测细胞数5000/孔，检测时间0,24,48,72小时；Transwell小室密度3×10^4，迁移时间24h；LDH检测细胞融合度80%；坏死性凋亡抑制剂NSA（15μM）和RIPA-56（1.0μM）处理24h 阅读提示：Methods: Proliferation and migration assay, LDH release assay, and Figure 7 legends |
| 体内实验 | C57BL/6小鼠（雌性，4-6周龄），LLC1细胞接种量1×10^6，皮下注射；抗PD-1抗体10mg/kg，每周三次，从第七天开始 阅读提示：Methods: In vivo treatments, Figure 8 legends |