单细胞转录组图谱构建
描绘PNI阳性dCCA的细胞组成，鉴定关键细胞亚群。
对2例PNI阳性dCCA肿瘤及癌旁组织进行scRNA-seq，鉴定出8种主要细胞类型，并进一步分析恶性细胞和施万细胞亚群。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
单细胞分析揭示GFAP+去分化施万细胞通过乳酸/HMGB1轴促进PNI阳性远端胆管癌的肿瘤进展
Single-cell analysis reveals that GFAP+ dedifferentiated Schwann cells promote tumor progress in PNI-positive distal cholangiocarcinoma via lactate/HMGB1 axis.
实验完整度
高包含scRNA-seq、体外细胞实验、动物模型及临床样本IHC等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
PNI阳性dCCA肿瘤及癌旁组织 CCLP1和HUCCT1人胆管癌细胞系 ipNF95.6人施万细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
缺氧条件：1% O2, 5% CO2, 94% N2, 48小时 乳酸处理浓度：10 mM，处理8小时 甘草酸（HMGB1抑制剂）浓度：1 nM 体内实验：5×10^6 CCLP1细胞与2×10^6 ipNF95.6细胞混合皮下注射 动物分组：每组8只，随机分为3组
摘要
远端胆管癌（dCCA）是一种高度致命的恶性肿瘤，约占原发性胆管癌患者的40%。显著的细胞异质性和神经周围浸润（PNI）是dCCA的两个典型特征。解析肿瘤细胞与神经细胞之间的复杂相互作用对于理解推动PNI阳性dCCA进展的机制至关重要。在此，我们对来自两对PNI阳性dCCA肿瘤及癌旁组织的24,715个细胞进行了单细胞RNA测序，鉴定了八种独特的细胞类型。恶性细胞表现出显著的肿瘤间和肿瘤内异质性。我们描绘了PNI阳性dCCA中五种施万细胞（SC）亚群的组成和功能表型。此外，我们的分析揭示了两个对形成PNI至关重要的潜在细胞亚型：具有缺氧倾向的NEAT1+恶性细胞和具有高代谢特征的GFAP+去分化SCs。进一步的生物信息学分析揭示了这两个亚群之间的广泛细胞相互作用。功能实验证实，缺氧肿瘤微环境中的乳酸可诱导SCs的GFAP去分化，进而通过上调HMGB1促进癌细胞的侵袭和进展。综上所述，我们的发现提供了PNI阳性dCCA转录谱的全面表征，并揭示了dCCA PNI的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在PNI阳性远端胆管癌中，肿瘤细胞与施万细胞之间的相互作用机制是什么，以及去分化施万细胞如何促进肿瘤进展？
- 核心机制
- 缺氧肿瘤微环境中的乳酸诱导施万细胞去分化（GFAP+），去分化施万细胞通过上调HMGB1促进癌细胞侵袭和进展。
- 主要证据
- scRNA-seq鉴定出NEAT1+恶性细胞和GFAP+去分化施万细胞；体外实验证实缺氧癌细胞分泌乳酸诱导施万细胞去分化并上调HMGB1；共培养实验和异种移植瘤模型证实乳酸处理的施万细胞促进肿瘤生长，而HMGB1抑制剂逆转该效应。
- 研究意义
- 研究提供了PNI阳性dCCA的转录组图谱，揭示了潜在的靶向治疗靶点，为设计针对PNI阳性肿瘤的治疗策略提供了数据资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
恶性细胞亚群鉴定与特征分析
揭示恶性细胞的异质性及与PNI相关的亚群。
对恶性细胞进行再聚类，鉴定出3个亚群，分析其缺氧状态、CNV水平、分化轨迹和临床相关性。
施万细胞亚群鉴定与特征分析
解析施万细胞的异质性，鉴定去分化施万细胞亚群。
对施万细胞进行再聚类，鉴定出5个亚群，分析其分化轨迹、代谢特征和临床相关性。
细胞间通讯分析
探究NEAT1+恶性细胞与GFAP+去分化施万细胞之间的相互作用。
使用CellChat和SCENIC分析细胞间配体-受体相互作用和基因调控网络。
体外验证缺氧诱导乳酸分泌及施万细胞去分化
验证缺氧癌细胞分泌乳酸并诱导施万细胞去分化。
将CCLP1和HUCCT1细胞在缺氧条件下培养，收集上清刺激ipNF95.6细胞，检测GFAP表达；测量乳酸水平；用乳酸处理施万细胞，检测去分化标志物。
验证乳酸诱导的HMGB1上调及对肿瘤行为的影响
验证乳酸上调施万细胞HMGB1并促进癌细胞迁移、侵袭和体内肿瘤生长。
用乳酸刺激ipNF95.6细胞，检测HMGB1表达；用甘草酸抑制HMGB1；与癌细胞共培养，进行划痕实验和Transwell侵袭实验；建立异种移植瘤模型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Solarbio | 12100 |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001-500 | |
| 乳酸处理 | 乳酸 | Merck | L1750 |
| 药物处理 | 甘草酸 | Yuanye Bio-Technology | B20417-20mg |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| HIF-1α抗体 | Abcam | ab51608 | |
| GFAP抗体 | Proteintech | 60190-1-Ig | |
| NCAM1抗体 | Proteintech | 14255-1-AP | |
| SOX2抗体 | CST | #2748 | |
| HMGB1抗体 | Proteintech | 66525-1-Ig | |
| 乳酸检测 | L-乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A019-2-1 |
| MTT实验 | MTT | Sigma | M5655 |
| RT-qPCR | TriQuick试剂 | Solarbio | R1100 |
| NovoScriptPlus cDNA合成预混液 | Novoprotein | E047-01B | |
| NovoStart SYBR qPCR预混液 | Novoprotein | E096-01A | |
| 免疫荧光 | HMGB1抗体 | Proteintech | 66525-1-Ig |
| Alexa Fluor 488二抗 | Servicebio | GB25301 | |
| Alexa Fluor 594二抗 | Abways | AB0152 | |
| 细胞侵袭实验 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| H&E染色 | 伊红 | BaSo Diagnostics | BA4098 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 样本类型、细胞活力、细胞浓度、测序平台、过滤参数 阅读提示：Methods: scRNA-seq and data analysis of dCCA tissues |
| 细胞培养与缺氧处理 | 细胞系、培养基、缺氧条件（1% O2）、处理时间（48小时） 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |
| 乳酸处理 | 乳酸浓度（10 mM）、处理时间（8小时） 阅读提示：Results: Hypoxia induces lactate secretion... 和 Methods: Cell culture and treatment |
| HMGB1抑制实验 | 甘草酸浓度（1 nM） 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |
| 共培养实验 | 共培养体系（24孔板，0.4 μm PET膜）、细胞密度、培养时间（48小时） 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（BALB/c nude）、周龄（5周）、性别（雌性）、分组（3组每组8只）、细胞数量（5×10^6 CCLP1 + 2×10^6 ipNF95.6）、注射方式（皮下） 阅读提示：Methods: Tumorigenicity assay |