鉴定CBP-1为UPRmt调节因子
筛选线虫中调控UPRmt激活的赖氨酸乙酰转移酶
利用hsp-6p::gfp报告基因，通过RNAi筛选线虫所有预测KATs，在cco-1 RNAi诱导的UPRmt背景下检测荧光变化。
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转录共激活因子CBP/p300是响应线粒体应激促进长寿的进化保守节点
The transcriptional coactivator CBP/p300 is an evolutionarily conserved node that promotes longevity in response to mitochondrial stress
实验完整度
高包含RNAi筛选、RNA-seq、ChIP-seq、Western blot、qRT-PCR、线虫寿命与感染实验，以及哺乳动物细胞敲除和过表达等至少两个独立证据层级，并含功能与机制验证。
主要模型
线虫（Caenorhabditis elegans） 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） 人肝癌细胞系HepG2
重点核对
CBP-1 RNAi的浓度（10%-60%）及对UPRmt激活的抑制作用 CBP/p300抑制剂A-485（10 μM）和PF-CBP1（80 μM）的处理浓度 线虫RNAi处理时各RNAi细菌的比例（如cco-1、mrps-5、cbp-1、atfs-1 RNAi所占百分比） 哺乳动物细胞Dox处理浓度（30 μg/ml）和时间（24小时） CBP/p300敲除MEFs的构建方法（4-OHT处理）
摘要
生物体通过激活包括线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）在内的多种防御途径来响应线粒体应激。然而，UPRmt调控因子如何协同转录激活应激反应仍 largely unknown。在这里，我们确定了CBP-1，哺乳动物乙酰转移酶CBP/p300的线虫直系同源物，是UPRmt以及线粒体应激诱导的免疫反应、淀粉样蛋白-β聚集减少和线虫寿命延长的必需调节因子。机制上，CBP-1作用于组蛋白去甲基化酶JMJD-1.2/JMJD-3.1下游和UPRmt转录因子ATFS-1上游，系统性诱导广泛的UPRmt基因并执行多种有益功能。在小鼠和人类群体中，CBP/p300的转录水平与UPRmt转录本和寿命正相关。此外，CBP/p300的抑制会破坏哺乳动物细胞中的UPRmt，而强制表达p300则足以激活UPRmt。这些结果突出了一个进化上保守的机制，该机制决定线粒体应激反应，并通过CBP/p300促进健康和长寿。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CBP-1/p300如何调控线粒体应激反应（UPRmt）从而影响寿命和健康？
- 核心机制
- CBP-1/CBP/p300在组蛋白去甲基化酶JMJD-3.1/JMJD-1.2下游和UPRmt转录因子ATFS-1上游，通过增加组蛋白H3K18Ac和H3K27Ac乙酰化，将线粒体应激信号传递给UPRmt基因的转录激活。
- 主要证据
- 线虫中cbp-1 RNAi抑制多种线粒体应激诱导的UPRmt激活，降低H3K18Ac/H3K27Ac水平并阻断ATFS-1结合；哺乳动物CBP/p300敲除或抑制A-485减弱Dox诱导的UPRmt基因表达和组蛋白乙酰化。
- 研究意义
- 揭示CBP/p300是进化保守的线粒体应激反应调节节点，可能成为治疗线粒体相关疾病、病原感染及衰老的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CBP-1对UPRmt激活的必需性
确认CBP-1在多种线粒体应激下的必需作用
在不同线粒体应激条件下（如cco-1, mrps-5, spg-7等RNAi，或药物处理），评估cbp-1 RNAi或抑制剂对UPRmt激活的影响。
转录组和表观遗传分析
探究CBP-1对UPRmt基因转录及组蛋白乙酰化的影响
对线虫进行RNA-seq和ChIP-seq，分析UPRmt基因表达和H3K18Ac/H3K27Ac富集变化。
验证CBP-1在JMJD-3.1/1.2和ATFS-1之间的位置
确定CBP-1在UPRmt调控通路中的上下游关系
在jmjd-3.1过表达线虫中敲低cbp-1检测UPRmt激活；在atfs-1(et18)突变体中敲低cbp-1检测UPRmt；检测ATFS-1结合UPRmt基因启动子。
评估CBP-1的生理功能
测试CBP-1对线虫免疫、寿命和蛋白毒性保护的影响
通过铜绿假单胞菌感染实验、寿命实验、Aβ毒性模型（GMC101）评估cbp-1敲低的影响。
验证哺乳动物细胞中CBP/p300的作用
探究CBP/p300在哺乳动物细胞UPRmt激活中的保守功能
在CBP/p300敲除的MEFs中检测Dox诱导的UPRmt基因表达；通过回补野生型或突变型p300验证乙酰转移酶活性；使用A-485抑制HepG2细胞中的CBP/p300活性。
人类和小鼠群体相关性分析
检查CBP/p300表达与UPRmt转录本及寿命的关联
利用BXD小鼠和GTEx人类数据库，分析CBP/p300与UPRmt基因的表达相关性及与寿命的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 线虫培养 | NGM琼脂平板 | -- | -- |
| RNA干扰 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| RNA提取 | TriPure分离试剂 | Roche | 11667165001 |
| NucleoSpin RNA试剂盒 | Macherey-Nagel | 740955.250 | |
| qRT-PCR | 逆转录试剂盒 | Qiagen | 205314 |
| LightCycler 480 SYBR Green I 预混液 | Roche | 04887352001 | |
| Western blot | 抗GFP抗体 | CST | 2956 |
| 抗Actin抗体 | Sigma | A5441 | |
| 抗H3K18Ac抗体 | Merck | 07-354 | |
| 抗H3K27Ac抗体 | abcam | ab4729 | |
| 抗H3K9Ac抗体 | Merck | 06-942 | |
| 抗H3K4Ac抗体 | abcam | ab176799 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | CST | 9715 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma | T5168 | |
| 抗H3K27Me3抗体 | millipore | 07-449 | |
| 抗H3K27Me2抗体 | abcam | ab24684 | |
| 抗H3K27Me1抗体 | millipore | 07-448 | |
| 抗H3K9Me1抗体 | millipore | 07-450 | |
| 抗H3K4Me3抗体 | millipore | 07-473 | |
| 抗组蛋白H4抗体 | Santa Cruz | sc-10810 | |
| 抗H4K5Ac抗体 | abcam | ab51997 | |
| 抗β-淀粉样蛋白1-16 (6E10)抗体 | BioLegend | 803001 | |
| 抗HA标签抗体 | CST | 3724 | |
| 抗Flag标签抗体 | Sigma | F7425 | |
| 抗Myc标签抗体 | Santa Cruz | sc-40 | |
| 抗GST标签抗体 | CST | 2625 | |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体 | CST | 9441 | |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体 | CST | 9814 | |
| HRP标记的抗兔二抗 | CST | 7074 | |
| HRP标记的抗鼠二抗 | CST | 7076 | |
| ChIP | 抗Flag M2磁珠 | Sigma | A2220 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | H7904 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher | L3000015 |
| 药物处理 | A-485 | TOCRIS | 6387 |
| PF-CBP1 | Selleck Chemicals | S8180 | |
| 多西环素 | Sigma | D9891 | |
| 曲古抑菌素A | Sigma | T8552 | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | |
| 质粒构建 | pGEX-4T-1载体 | -- | -- |
| L4440空载体 | -- | -- | |
| 测序 | BGISEQ-500测序平台 | BGI | -- |
| 生化分析 | 乙酰辅酶A | -- | -- |
| 表达载体 | 野生型p300质粒 | addgene | 89094 |
| p300突变体质粒 | addgene | 89095 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNA干扰 | RNAi细菌的培养条件（LB含25 μg/ml羧苄青霉素，IPTG诱导），RNAi处理起始时间（母体L4期），以及双RNAi时各细菌的比例 阅读提示：Methods: RNA interference |
| 药物处理 | Antimycin A和Doxycycline的最终浓度，以及加入NGM培养基的时机 阅读提示：Methods: Induction of the UPRmt |
| RNA-seq分析 | RNA提取方法、文库构建、测序平台，以及差异表达基因的筛选标准（log2FC > 0.5, adjusted P < 0.05） 阅读提示：Methods: RNA extraction and RNA-seq analysis |
| Western blot | 抗体列表（克隆号、稀释比例、品牌和货号），以及蛋白提取方法 阅读提示：Methods: Western blotting |
| ChIP | 固定时间（1%甲醛30分钟），抗体（H3K18Ac和H3K27Ac的稀释比例），以及anti-Flag M2 beads用于ATFS-1 ChIP 阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq of worms |
| 线虫寿命实验 | 每组样本量（75-100），记录频率（每隔一天），以及数据审查标准（消失或外阴爆裂） 阅读提示：Methods: C. elegans strains（描述寿命实验时提及），更具体在Results中Fig. 4d,e的图注 |
| 铜绿假单胞菌感染实验 | 感染平板制备（0.35%蛋白胨，37°C孵育24小时，25°C平衡24小时），以及worms计数方法（每12小时） 阅读提示：Methods: Pseudomonas aeruginosa infection assay |
| 细胞培养与处理 | MEFs的敲除方法（4-OHT处理浓度2 μM，每12小时更换，共2天），以及HepG2细胞培养条件（DMEM含4.5 g/L葡萄糖和10% FBS） 阅读提示：Methods: Cell culture and drug treatment |