病理图像深度学习预测模型
利用病理图像特征预测NB-BBM的发生状态，以实现早期诊断。
使用Swin-Transformer模型分析142张HE染色切片图像，进行特征提取和训练，评估模型在训练集、验证集和测试集上的性能，并通过多变量Cox回归分析NB-BBM患者的预后。
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骨或骨髓转移的神经母细胞瘤的综合多组学特征分析
Integrated multi-omics characterization of neuroblastoma with bone or bone marrow metastasis.
实验完整度
高包括病理图像深度学习预测模型、单细胞转录组分析、体外细胞功能实验、动物移植瘤模型及免疫组化验证等多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
SK-N-SH细胞系 SH-SY5Y细胞系 裸鼠皮下移植瘤模型 神经母细胞瘤患者肿瘤组织
重点核对
Swin-Transformer模型在训练集、验证集和测试集上的准确率分别为93.14%、92.86%（13/14）和85.7%（12/14）。 NB-BBM与SPP1+ TAMs（P=0.0023）和IGHM+ TAMs（P=0.035）的相关性。 TKT敲低后细胞增殖、集落形成、细胞周期G1-S期转换的变化，以及体内肿瘤体积和重量的降低。 TKT高表达与NB患者较差预后的相关性（生存分析）。
摘要
骨或骨髓转移的神经母细胞瘤（NB-BBM）的发病机制及其复杂的免疫微环境仍未得到充分阐明，这阻碍了有效的BBM风险预测的进展，并限制了治疗策略。使用Swin-Transformer对142张石蜡包埋的苏木精-伊红染色的肿瘤切片图像进行特征识别，以预测NB-BBM的发生。单细胞转录组学鉴定了一个肿瘤细胞亚群（NB3）和两个与BBM密切相关的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群（SPP1+ TAMs和IGHM+ TAMs），并强调转酮醇酶（TKT）是NB转移进展的关键分子标志物。这项对NB-BBM的广泛多组学研究增强了我们在现有研究之外对NB单细胞转录动力学的理解，概述了从原位癌经过肿瘤发生到骨髓转移的演变过程。此外，对免疫微环境的探索确定了促进NB-BBM的关键TAM特异性亚群，为免疫治疗提供了新途径。这些见解增强了我们对NB向BBM转移过程的理解，并有助于为这种侵袭性儿科癌症开发更有效的诊断和治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索神经母细胞瘤（NB）发生骨或骨髓转移（BBM）的机制，并寻求预测BBM风险及潜在治疗靶点的方法。
- 核心机制
- NB-BBM肿瘤细胞亚群NB3通过激活氧化磷酸化促进转移；SPP1+和IGHM+ TAMs在免疫微环境中富集并通过氧化磷酸化和异常TGF-β1表达促进NB-BBM；TKT通过影响细胞周期（上调CCND1/CCND2）促进NB细胞生长。
- 主要证据
- 基于病理图像的深度学习模型预测NB-BBM；单细胞转录组学鉴定关键亚群；体外实验显示TKT敲低降低细胞增殖、克隆形成并阻滞G1-S期；体内实验显示肿瘤体积和重量减小；免疫组化显示SPP1+ TAMs富集及PD-L1高表达。
- 研究意义
- 这些发现增进了对NB向BBM转移过程的理解，为开发更有效的诊断和治疗策略（如免疫治疗和靶向TKT）提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析
描绘NB原发肿瘤和BBM的细胞异质性，鉴定与BBM相关的关键细胞亚群和分子变化。
对31个样本（包括19个原发NB和12个BBM样本）进行单细胞转录组测序，鉴定细胞类型和亚群，分析NB3肿瘤细胞亚群和TAM亚群在G1/G2/G3组中的分布，并进行CNV分析和功能富集分析。
体外功能实验验证TKT的功能
验证TKT对神经母细胞瘤细胞增殖和细胞周期的影响。
在SK-N-SH和SH-SY5Y细胞系中通过慢病毒介导的shRNA敲低TKT，进行CCK-8细胞增殖实验、EdU增殖实验、克隆形成实验、Western blot检测细胞周期相关蛋白及流式细胞术分析细胞周期变化。
体内移植瘤实验
评估TKT敲低对神经母细胞瘤体内生长的影响。
将稳定敲低TKT（shTKT）或对照（shCtrl）的SH-SY5Y细胞皮下接种到裸鼠，监测肿瘤体积和重量。
免疫微环境分析
研究NB-BBM中的免疫细胞浸润和免疫治疗潜在靶点。
使用CIBERSORT分析免疫细胞浸润，ESTIMATE评估肿瘤纯度，GSVA通路富集分析，免疫组化检测PD-L1表达，以及评估微卫星不稳定性和肿瘤突变负荷。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病理切片扫描 | SQS-40P | TEKSQRAY | -- |
| 单细胞RNA文库构建 | GEXSCOPE单细胞RNA文库构建试剂盒 | Singleron Biotechnologies | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成 | Evo M-MLV RT Mix 试剂盒 | Accurate Biology | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR 试剂盒II | Accurate Biology | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒8 | -- | -- |
| BeyoClick™ EdU细胞增殖检测试剂盒（Alexa Fluor 555） | Beyotime | -- | |
| Western blot | CCND1抗体 | Proteintech | 60186-1-Ig |
| CCND2抗体 | Proteintech | 10934-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 免疫组化 | PD-L1抗体 | DAKO | 22C3 |
| 多重免疫荧光 | SPP1抗体 | Proteintech | -- |
| IGHM抗体 | Proteintech | -- | |
| CD68抗体 | Abcam | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病理图像深度学习模型 | 切片扫描仪型号（SQS-40P），图像尺寸（1024×1024），训练集/验证集/测试集划分比例（8:1:1），模型训练轮数（100），准确率。 阅读提示：Methods 'Data preprocessing' 和 'Feature extraction by Swin-Transformer model' 及 Results 'Machine learning for predicting NB-BBM occurrence status using histopathological images'。 |
| 单细胞转录组测序 | 患者样本数（10例CH-CMU，21例GEO），文库构建试剂盒（GEXSCOPE），分析方法（Seurat, InferCNV, Monocle, CellChat），细胞簇数量及标记基因。 阅读提示：Methods 'Single-cell data analysis' 和 Results 'The single-cell transcriptomic landscape of primary NB and NB-BBM'。 |
| 细胞系与培养条件 | 细胞系：SK-N-SH和SH-SY5Y；培养基：含10%血清和1%青霉素/链霉素；培养条件：37°C，5% CO2。 阅读提示：Methods 'Cell culture and transfection'。 |
| TKT敲低实验 | shRNA靶序列（shTKT: GCTGAGCTGCTGAAGATGTTTTTCAAGAGAAAACATCTTCAGCAGCTCAGC），慢病毒转染效率，细胞增殖检测时间点（0, 24, 48, 72小时）。 阅读提示：Methods 'Cell culture and transfection' 和 'Cell proliferation'。 |
| 体内移植瘤模型 | 细胞数量（3×10^6），基质胶混合比例，肿瘤大小测量方法（电子卡尺），最大直径限制（1 cm），动物伦理批准编号。 阅读提示：Methods 'Xenograft tumor model'。 |