体外筛选二萜类化合物对 NLRP3 炎症小体的抑制作用
筛选能够抑制 NLRP3 炎症小体激活的天然二萜类化合物
使用 LPS 预刺激的 BMDMs，以尼日利亚霉素（nigericin）激活 NLRP3 炎症小体，评估多种二萜类化合物对 IL-1β 分泌的抑制作用
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Rosthornin B 通过直接靶向 NLRP3 缓解炎症性疾病
Rosthornin B alleviates inflammatory diseases via directly targeting NLRP3.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（BMDMs、THP-1）、机制实验（免疫共沉淀、SPR、分子对接）以及多种体内动物模型（LPS 诱导的脓毒性休克、MSU 诱导的腹膜炎、DSS 诱导的结肠炎），并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 人单核细胞系 THP-1 HEK-293T 细胞（用于外源性相互作用研究） C57BL/6J 小鼠（LPS 诱导的脓毒性休克、MSU 诱导的腹膜炎、DSS 诱导的结肠炎模型）
重点核对
Ros B 对 NLRP3 炎症小体抑制的 IC50 值为 0.39 μM Ros B 直接结合 NLRP3，KD 值为 5.491 μM（SPR 检测） Ros B 抑制 NEK7-NLRP3 相互作用，但不影响 NLRP3-NLRP3 相互作用 在 BMDMs 中，Ros B 剂量依赖性地抑制 nigericin、ATP、MSU 和胞内 LPS 诱导的 caspase-1 裂解和 IL-1β 分泌 体内实验中，Ros B 剂量为 10 mg/kg（腹腔注射），在 LPS 诱导的脓毒性休克、MSU 诱导的腹膜炎和 DSS 诱导的结肠炎模型中均显示治疗效果
摘要
NLRP3 炎症小体的异常激活促进多种炎症性疾病的发展。抑制 NLRP3 炎症小体已被证明是治疗 NLRP3 驱动的疾病的有效策略。本研究揭示了来自香茶菜属（Isodon）植物的多种天然二萜类化合物可以抑制 NLRP3 炎症小体，其中 Rosthornin B（Ros B）表现出最佳的抑制效果，其 IC50 为 0.39 μM。进一步研究发现，Ros B 直接与 NLRP3 相互作用，从而抑制 NEK7-NLRP3 相互作用，并抑制 NLRP3 炎症小体的组装和激活。值得注意的是，Ros B 在 NLRP3 驱动的脓毒性休克、腹膜炎和结肠炎的小鼠模型中具有显著的治疗效果。我们的研究确定了一系列靶向 NLRP3 炎症小体的天然二萜类化合物。这些天然二萜类化合物，尤其是具有低 IC50 值的化合物，可能促进针对 NLRP3 炎症小体激活驱动的疾病的新药开发和潜在临床疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 来自香茶菜属的天然二萜类化合物是否能通过直接靶向 NLRP3 抑制 NLRP3 炎症小体激活，从而缓解炎症性疾病？
- 核心机制
- Ros B 直接结合 NLRP3，阻断 NEK7-NLRP3 相互作用，从而抑制 NLRP3 炎症小体的组装和激活
- 主要证据
- 体外实验显示 Ros B 抑制多种 NLRP3 刺激物诱导的 caspase-1 裂解和 IL-1β 分泌；免疫共沉淀显示 Ros B 抑制 NEK7-NLRP3 和 NLRP3-ASC 相互作用；SPR 显示 Ros B 直接结合 NLRP3；体内实验显示 Ros B 在 LPS 诱导的脓毒性休克、MSU 诱导的腹膜炎和 DSS 诱导的结肠炎模型中减轻疾病严重程度
- 研究意义
- 该研究确定了一系列来自香茶菜属的天然二萜类化合物，特别是 Ros B，可作为开发靶向 NLRP3 炎症小体驱动的疾病的新药的先导化合物
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证 Ros B 对 NLRP3 炎症小体激活的特异性抑制
验证 Ros B 是否特异性抑制 NLRP3 炎症小体，而不是其他炎症小体或炎症通路
在 BMDMs 和 THP-1 细胞中，用不同 NLRP3 刺激物（nigericin、ATP、MSU）和 AIM2 炎症小体刺激物 poly(A:T) 处理，检测 Ros B 对 caspase-1 裂解和 IL-1β 分泌的影响；同时检测 Ros B 对非炎症小体依赖的 TNF-α 和 IL-6 产生的影响
研究 Ros B 对 NLRP3 炎症小体组装的影响
确定 Ros B 是否通过影响 NLRP3 炎症小体组装（特别是 NEK7-NLRP3 相互作用）发挥抑制作用
在 BMDMs 中通过免疫共沉淀检测 Ros B 对 NEK7-NLRP3 和 NLRP3-ASC 相互作用的影响；在 HEK-293T 细胞中检测 Ros B 对外源性 NEK7-NLRP3 和 NLRP3-NLRP3 相互作用的影响
验证 Ros B 直接结合 NLRP3
验证 Ros B 是否直接与 NLRP3 蛋白结合
使用表面等离子体共振（SPR）检测 Ros B 与重组人 NLRP3 蛋白的结合亲和力；使用 AutoDock4 进行分子对接预测结合位点
评估 Ros B 在 LPS 诱导的脓毒性休克模型中的效果
评估 Ros B 在体内对 NLRP3 驱动的脓毒性休克是否具有治疗效果
小鼠腹腔注射 Ros B (10 mg/kg) 后 50 分钟，注射 LPS (20 mg/kg) 诱导脓毒性休克，检测血清 IL-1β 和 TNF-α 水平，并观察生存率
评估 Ros B 在 MSU 诱导的腹膜炎模型中的效果
评估 Ros B 在 MSU 诱导的腹膜炎模型中是否减少炎症反应
小鼠腹腔注射 Ros B (10 mg/kg) 后 50 分钟，注射 MSU (100 mg/kg) 诱导腹膜炎，6 小时后收集腹腔灌洗液，检测 IL-1β 水平和中性粒细胞浸润
评估 Ros B 在 DSS 诱导的结肠炎模型中的效果
评估 Ros B 对 DSS 诱导的结肠炎是否具有治疗作用
小鼠饮用含 3% DSS 的水 7 天诱导结肠炎，每天腹腔注射 Ros B (10 mg/kg)，记录体重和疾病活动指数，评估结肠长度、组织学损伤、caspase-1 和 IL-1β 水平以及 Th17 细胞比例
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 试剂获取 | Rosthornin B | Desite | -- |
| 二萜类化合物 | TargetMol | -- | |
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | CB34 |
| 脂多糖 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
| poly (A:T) | InvivoGen | tlrl-patn | |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | |
| 免疫沉淀 | 蛋白 G 琼脂糖 | Millipore | -- |
| 细胞培养 | 尼日利亚霉素 | Sigma | N7143 |
| 尿酸单钠 | Sigma | U0881 | |
| 脂多糖 | Sigma | L2630 | |
| 三磷酸腺苷 | Sigma | A2383 | |
| 佛波酯 | Sigma | 79346 | |
| 免疫印迹 | 抗小鼠 NLRP3 抗体 | Adipogen | AG-20B-0014 |
| 抗小鼠 caspase-1 抗体 | Adipogen | AG-20B-0042 | |
| 抗 β-actin 抗体 | Abmart | P30002 | |
| 抗 NEK7 抗体 | Abcam | ab133514 | |
| 抗小鼠 IL-1β 抗体 | Cell Signaling Technology | 12507S | |
| 抗小鼠 ASC 抗体 | Cell Signaling Technology | 67824S | |
| 抗人 caspase-1 抗体 | Cell Signaling Technology | 2225 | |
| ELISA | IL-6 ELISA 试剂盒 | R&D | DY406 |
| IL-1β ELISA 试剂盒 | R&D | DY401 | |
| TNF-α ELISA 试剂盒 | Invitrogen | 88-7324-22 | |
| TNF-α ELISA 试剂盒（人） | R&D | DY201 | |
| LDH 活性检测 | LDH 检测试剂盒 | Promega | G1780 |
| 细胞活力检测 | CCK-8 试剂 | -- | -- |
| 共聚焦显微镜 | MitoTracker | -- | -- |
| MitoSOX | -- | -- | |
| 盖玻片 | Biosharp | -- | |
| SPR | BIAcore 3000 | GE Healthcare | -- |
| 流式细胞术 | 抗 CD16/32 抗体 | BioLegend | -- |
| 细胞刺激混合物 | eBioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与活化 | BMDMs 培养条件（M-CSF 浓度 50 ng/mL，5-7 天）；LPS 预刺激浓度和时间（50 ng/mL，3 小时）；Ros B 处理时间（30 分钟）；NLRP3 刺激物浓度和时间（nigericin 10 μM、ATP 5 mM、MSU 300 μg/mL）；THP-1 分化条件（PMA 400 ng/mL） 阅读提示：Materials and Methods 2.3 Cell culture and activation procedures |
| 免疫印迹 | 抗体信息（anti-NLRP3, anti-caspase-1 等）；蛋白分离和转移条件（SDS-PAGE 电泳、PVDF 膜、封闭等） 阅读提示：Materials and Methods 2.4 Immunoblotting |
| 免疫沉淀 | 细胞裂解液体积（300 μL NP-40 buffer）；离心条件（6080 × g，10 分钟）；抗体比例（1:100）；孵育条件（4°C 过夜） 阅读提示：Materials and Methods 2.5 Immunoprecipitation |
| 共聚焦显微镜 | 细胞密度（2×10^5 cells/mL）；LPS 浓度（100 ng/mL）；Ros B 浓度（2 μM）；MitoTracker 浓度（200 nM）；MitoSOX 浓度（1 μM）；nigericin 浓度（10 μM）；固定方法（4% PFA） 阅读提示：Materials and Methods 2.6 Confocal microscopy |
| 体内实验 | 小鼠品系、性别、年龄（C57BL/6J，雄性，8-10 周龄）；Ros B 剂量（10 mg/kg，腹腔注射）；LPS 剂量（20 mg/kg）；MSU 剂量（100 mg/kg）；DSS 浓度（3% w/v，7 天）；每组动物数 阅读提示：Materials and Methods 2.12-2.14；Figure legends 5 and 6 |