circNAP1L4在低氧和PH血浆中的表达分析
检测circNAP1L4在低氧HPASMCs和PH患者血浆中的表达水平，并验证其环状特性。
通过qRT-PCR检测低氧和常氧条件下HPASMCs中circNAP1L4的表达；使用RNase R和放线菌素D处理验证其环状结构和稳定性；通过FISH检测其亚细胞定位；检测PH患者和健康对照血浆中的circNAP1L4水平。
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circNAP1L4通过NAP1L4介导的超增强子驱动的糖酵解基因己糖激酶II（HK II）调控肺动脉高压中肺动脉平滑肌细胞增殖
CircNAP1L4 regulates pulmonary artery smooth muscle cell proliferation via the NAP1L4-mediated super-enhancer-driven glycolysis gene hexokinase II (HK II) in pulmonary hypertension.
实验完整度
高包含体外细胞实验、动物模型（SuHx小鼠）、患者血浆样本及机制验证（RNA pull-down、RIP、ChIP-qPCR、Co-IP等）。
主要模型
人肺动脉平滑肌细胞（HPASMCs） 人肺动脉内皮细胞（HPAECs） SuHx诱导的PH小鼠模型 PH患者血浆样本（队列）
重点核对
细胞模型：HPASMCs（批次数n=6，代次<5）在3% O2低氧条件下培养24小时。 动物模型：雄性C57BL/6J小鼠（20-25g），通过鼻腔滴注AAV5载体（10^11基因组当量）过表达circNAP1L4，7-14天后分为常氧组与低氧组，SU5416（20mg/kg皮下注射）联合10% O2低氧3周，再常氧2周建立SuHx模型。 干预方式：circNAP1L4过表达质粒（GV486载体）转染HPASMCs，使用Lipofectamine 2000和X-tremeGene siRNA。 关键剂量：JQ1（250 nM）处理HPASMCs抑制超增强子。 验证方法：CCK8、EdU、Ki67染色、流式细胞术检测细胞周期，Seahorse XFe24检测ECAR，Western blot检测蛋白表达，ChIP-qPCR检测HK II增强子区H3K27ac、H3K4me1和CEBPB富集。
摘要
糖酵解是肺动脉高压（PH）中肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖的主要决定因素。环状RNA（circRNAs）在多种疾病中是糖酵解的有力调节因子；然而，circRNAs在PH糖酵解中的作用尚未得到很好的表征。本研究旨在揭示一种新的circRNA，circNAP1L4，通过其宿主蛋白NAP1L4调节超增强子驱动的糖酵解基因己糖激酶II（HK II），从而调控人肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）增殖的调控机制。CircNAP1L4在低氧HPASMCs和PH患者血浆中下调。在功能上，circNAP1L4过表达抑制了低氧HPASMCs的糖酵解和增殖。在机制上，circNAP1L4直接与其宿主蛋白NAP1L4结合，影响NAP1L4进入细胞核的能力，从而调节HK II超增强子的表观基因组信号。有趣的是，circNAP1L4过表达抑制了与HPASMCs共培养的人肺动脉内皮细胞（HPAECs）的增殖，但不抑制其迁移。此外，发现前体mRNA加工剪接因子8（PRP8）调节circNAP1L4和线性NAP1L4的产生比例。在体内，靶向circNAP1L4可减轻SU5416联合低氧（SuHx）诱导的PH。总的来说，这些发现揭示了一种新的circRNA，它抑制PASMC增殖，并作为PH的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circNAP1L4是否通过宿主蛋白NAP1L4调节超增强子驱动的糖酵解基因HK II，从而影响肺动脉高压中肺动脉平滑肌细胞的增殖？
- 核心机制
- 低氧诱导剪接因子PRP8表达升高，导致circNAP1L4生成减少，线性NAP1L4增加；circNAP1L4与NAP1L4蛋白结合减少，使NAP1L4入核增多，进而增加HK II的超增强子修饰（H3K27ac、H3K4me1）并招募转录因子CEBPB，促进HK II转录，增强糖酵解，促进PASMC增殖。
- 主要证据
- 体外实验显示circNAP1L4过表达抑制低氧诱导的HPASMC增殖和糖酵解；机制研究通过RNA pull-down、RIP、Co-IP、ChIP-qPCR验证circNAP1L4与NAP1L4结合及对HK II超增强子的调控；体内实验表明AAV5介导的circNAP1L4过表达减轻SuHx诱导的PH小鼠的右心室收缩压、肺血管重塑和细胞增殖。
- 研究意义
- 揭示了circNAP1L4/NAP1L4/HK II轴在PH发病中的新机制，circNAP1L4可能作为PH的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circNAP1L4对HPASMC增殖和糖酵解功能的影响
评估circNAP1L4过表达对低氧诱导的HPASMC增殖和糖酵解的影响。
构建circNAP1L4过表达质粒并转染HPASMCs，通过CCK8、EdU、Ki67染色、流式细胞术检测细胞增殖和周期；通过Western blot检测增殖相关蛋白；通过Seahorse检测ECAR，检测乳酸、丙酮酸和ATP含量。
circNAP1L4与NAP1L4蛋白的相互作用及对核转位的影响
验证circNAP1L4是否直接结合NAP1L4并影响其核转位。
通过catRAPID预测结合位点，RNA pull-down和RIP验证结合；通过免疫荧光和核质分离检测NAP1L4的定位。
NAP1L4对HK II超增强子修饰的调控机制
阐明NAP1L4如何调节HK II的超增强子修饰及转录。
通过Co-IP验证NAP1L4与H3K27ac的相互作用；使用JQ1抑制超增强子，检测HK II表达；通过ChIP-qPCR检测H3K27ac、H3K4me1和CEBPB在HK II增强子和启动子区域的富集。
PRP8对circNAP1L4和线性NAP1L4表达的调控
验证剪接因子PRP8是否调控circNAP1L4和线性NAP1L4的表达比例。
检测低氧下剪接因子表达，敲低PRP8后检测circNAP1L4和线性NAP1L4表达，RIP验证PRP8与NAP1L4 pre-mRNA结合。
体内验证circNAP1L4对SuHx诱导PH的保护作用
评估circNAP1L4过表达对SuHx小鼠模型PH相关指标的改善作用。
使用AAV5载体鼻腔滴注过表达circNAP1L4，建立SuHx模型，测量RVSP、右心室肥厚指数、超声心动图、组织学染色和免疫荧光。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 5型腺相关病毒 | Genechem | -- |
| SU5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基 | Sciencell | 1001 |
| 平滑肌细胞培养基 | Sciencell | 1101 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013B |
| 抗PCNA抗体 | Cell Signaling Technology | 2586 | |
| 抗细胞周期蛋白A抗体 | Boster | BM4674 | |
| 抗细胞周期蛋白D抗体 | ABclonal | A11022 | |
| 抗NAP1L4抗体 | Proteintech | 16018-1-AP | |
| 抗HKII抗体 | Proteintech | 22029-1-AP | |
| 抗PKM2抗体 | ABclonal | A0268 | |
| 抗PRP8抗体 | ABclonal | A6053 | |
| 抗H3K27ac抗体 | ABclonal | A7253 | |
| 抗H3K4me1抗体 | ABclonal | A2355 | |
| 抗CEBPB抗体 | GeneTex | GTX100675 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 血液/血浆RNA提取试剂盒 | HaiGene | -- | |
| Norgen细胞质和细胞核RNA纯化试剂盒 | Norgen | -- | |
| qRT-PCR | Superscript第一链cDNA合成试剂盒 | HaiGene | -- |
| SYBR Green实时PCR | Toyobo | -- | |
| LightCycler 480II | Roche | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂 | -- | -- |
| 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Beyotime | C0071S | |
| 细胞周期分析 | 细胞周期和凋亡分析试剂盒 | Beyotime | C1052 |
| 糖酵解分析 | Seahorse XF24细胞外通量分析仪 | Seahorse Biosciences | -- |
| Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 代谢物检测 | 乳酸含量检测试剂盒 | Solarbio | BC2230 |
| ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 | |
| 细胞共培养 | Transwell小室 | Costar | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | -- | -- |
| X-tremeGene siRNA转染试剂 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| Cy3标记山羊抗兔抗体 | Beyotime Biotechnology | A0516 | |
| FITC标记山羊抗小鼠抗体 | Beyotime Biotechnology | A0568 | |
| 抗淬灭封片剂 | Beyotime Biotechnology | P0126 | |
| 抗Ki67抗体 | Boster | M00254-3 | |
| 抗α-SMA抗体 | Cell Signaling Technology | 19245 | |
| 抗HKII抗体 | Boster | MA01389 | |
| RNA稳定性实验 | RNase R | Epicenter Biotechnologies | -- |
| ChIP-qPCR | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P2078 |
| RNA免疫沉淀 | RNA免疫沉淀试剂盒 | BersinBio | Bes5101 |
| RNA pull-down | RNA pull-down试剂盒 | Bersinbio | -- |
| RNA标记 | Label IT Tracker细胞内核酸定位试剂盒 | Mirus | -- |
| 蛋白提取 | 核质蛋白提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0027 |
| 动物实验 | 阿佛丁 | Sigma Aldrich | -- |
| PowerLab监测设备 | AD Instruments | -- | |
| 1.2 French压力导管 | Scisense Inc | -- | |
| Vevo2100成像系统 | VisualSonics | -- | |
| 图像分析 | Image-Pro Plus 6.0软件 | -- | -- |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与低氧处理 | HPASMCs使用Sciencell平滑肌细胞培养基（含15% FBS和1%青霉素-链霉素），在3% O2和5% CO2低氧条件下培养24小时；所有实验使用6批细胞，代次小于5代。 阅读提示：见Methods 2.5 Cell culture |
| 动物模型建立 | 雄性C57BL/6J小鼠（20-25g），AAV5载体（10^11基因组当量）鼻滴给药，7-14天后分为常氧（FiO2 0.21）和低氧（FiO2 0.10）组；SU5416（20mg/kg）皮下注射，低氧3周后常氧2周建立SuHx模型。 阅读提示：见Methods 2.2 Animal treatments and lung tissue preparation |
| circNAP1L4过表达 | 使用GV486载体构建过表达质粒，转染3 μg质粒或2 μg siRNA；转染试剂为Lipofectamine 2000和X-tremeGene siRNA，转染后4-6小时更换为5%血清培养基，继续培养24小时。 阅读提示：见Methods 2.10 Plasmid and siRNA construction and transfection |
| 糖酵解检测 | Seahorse XF24检测ECAR，细胞密度8000个/孔，依次加入葡萄糖10 mM、寡霉素1 μM、2-DG 50 mM；乳酸、丙酮酸和ATP含量分别使用对应试剂盒检测。 阅读提示：见Methods 2.13 Glycolysis assay 和 2.14 Lactate, pyruvic acid, and ATP content assay |
| 超增强子分析 | ChIP-qPCR检测H3K27ac、H3K4me1和CEBPB在HK II增强子区域的富集；JQ1处理浓度为250 nM。 阅读提示：见Methods 2.21 Chromatin immunoprecipitation–quantitative PCR (ChIP–qPCR) 和 Figure 4 |