Amentoflavone reverses epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells by targeting p53 signalling pathway axis.
包含生物信息学分析（GEO、TCGA数据挖掘、预后模型）、网络药理学（PPI、GO/KEGG富集）、分子对接，以及体外细胞实验（CCK-8、伤口愈合、Transwell、流式凋亡、Western blot）多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
MHCC97H人肝癌细胞系 MHCCLM3人肝癌细胞系 TGF-β1诱导的HCC EMT细胞模型 TCGA-LIHC肝细胞癌队列
GSE84402数据集差异基因筛选标准：p<0.05且|log2(FC)|>2 EMT细胞模型建立条件：20 ng/mL TGF-β1处理48小时 穗花杉双黄酮处理浓度：100、200、300 μmol/L，处理24小时 MHCC97H和MHCCLM3细胞的IC50值分别为197 μM和314.5 μM 统计分析样本量为n=3，使用单因素方差分析
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定穗花杉双黄酮调控的与肝细胞癌预后相关的EMT相关基因。
从GEO数据库下载GSE84402数据集，使用R语言limma包进行差异分析；从GeneCards数据库获取EMT相关基因；利用SwissTarget Prediction、PharmMapper和TargetNet预测穗花杉双黄酮靶点；取三者交集得到14个候选基因；利用TCGA-LIHC数据验证差异表达和预后相关性，并通过LASSO回归筛选出NR1I2、CDK1和CHEK1三个核心基因。
评估核心基因风险评分对肝细胞癌患者预后的预测能力。
基于NR1I2、CDK1和CHEK1的表达值，利用Cox回归构建风险评分公式，将TCGA-LIHC患者分为高低风险组，绘制Kaplan-Meier曲线和ROC曲线，评估1年、3年和5年生存预测效能，并构建列线图进行校准分析。
预测穗花杉双黄酮作用于核心靶点的信号通路，并验证其结合能力。
将14个候选基因导入STRING构建PPI网络，利用R软件进行GO和KEGG富集分析，发现富集于p53信号通路。利用AutoDock Vina将穗花杉双黄酮与CDK1、CHEK1和IGF1蛋白进行分子对接。
模拟肝细胞癌上皮间质转化状态，用于后续药效评估。
使用20 ng/mL TGF-β1处理MHCC97H和MHCCLM3细胞48小时，通过HE染色观察细胞形态变化，并通过RT-PCR和Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平，验证EMT模型成功建立。
测定穗花杉双黄酮对HCC细胞的毒性及半数抑制浓度。
CCK-8实验检测不同浓度穗花杉双黄酮处理24小时后的细胞活力，计算IC50值。
验证穗花杉双黄酮能否抑制HCC EMT细胞的迁移和侵袭能力。
分别采用伤口愈合实验和Transwell实验检测不同浓度穗花杉双黄酮处理24小时或48小时后细胞的迁移率和穿膜细胞数。
检测穗花杉双黄酮是否诱导HCC EMT细胞凋亡。
采用Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术分析各组细胞的凋亡比例。
验证穗花杉双黄酮逆转EMT是否通过p53信号通路轴。
Western blot检测EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）和p53信号通路相关蛋白（p53、CHEK1、CDK1、IGF1）的表达水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 生物信息学分析 | R语言limma包 | -- | -- |
| ggplot2包 | -- | -- | |
| glmnet包 | -- | -- | |
| timeROC包 | -- | -- | |
| rms包 | -- | -- | |
| survival包 | -- | -- | |
| ClusterProfiler包 | -- | -- | |
| org.Hs.eg.db包 | -- | -- | |
| 网络药理学分析 | STRING数据库 | -- | -- |
| Cytoscape软件 | -- | -- | |
| 分子对接 | ChemBio 3D软件 | -- | -- |
| AutoDock Vina软件 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Procell | PM15210 |
| 磷酸盐缓冲液 | Procell | PB180327 | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Procell | PB180120 | |
| 0.25%胰蛋白酶 | ECTOP | -- | |
| 穗花杉双黄酮 | Shanghaiyuanye BioTechnology Co., Ltd. | B21229 | |
| 转化生长因子-β1 | Novoprotein | CA59 | |
| 细胞功能实验 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 体外侵袭实验 | Matrigel基质胶 | Corning | 356234 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | APExBIO | K2003 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液（强） | CWBIO | CW2333 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P0010 |
| Western blot | E-钙黏蛋白多克隆抗体 | Proteintech | 20874-1-AP |
| N-钙黏蛋白多克隆抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 波形蛋白多克隆抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| CDK1多克隆抗体 | Proteintech | 10762-1-AP | |
| CHEK1多克隆抗体 | Proteintech | 25887-1-AP | |
| IGF1多克隆抗体 | Proteintech | 28530-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Affinity Biosciences | AF7018 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 生物信息学分析 | GSE84402数据集差异基因筛选阈值p<0.05且|log2(FC)|>2；TCGA-LIHC数据提取及差异表达验证方法；LASSO回归筛选核心基因的具体参数。 阅读提示：Methods 2.1.1-2.1.6 |
| EMT细胞模型建立 | MHCC97H和MHCCLM3细胞的来源、代数；TGF-β1浓度20 ng/mL及处理48小时；模型成功的标志物变化（E-cadherin下调，N-cadherin和Vimentin上调）。 阅读提示：Methods 2.3.3 和 Results 3.4 |
| 穗花杉双黄酮处理 | 药物浓度（100、200、300 μmol/L）和处理时间24小时；对照组和处理组的设置；细胞密度和培养条件。 阅读提示：Methods 2.3.4 |
| 细胞活力检测 | CCK-8实验的细胞接种密度、药物浓度梯度、处理时间和IC50值。 阅读提示：Methods 2.3.2 和 Results 3.5 |
| 细胞迁移和侵袭检测 | 伤口愈合实验划痕后观察时间点（0、24、48小时）；Transwell实验细胞接种数、基质胶和培养时间；药物处理方案。 阅读提示：Methods 2.3.5、2.3.6 和 Results 3.6 |
| 细胞凋亡检测 | 凋亡检测的具体操作步骤、细胞密度、染料浓度及流式分析时间窗口。 阅读提示：Methods 2.3.7 |
| Western blot | 蛋白质提取方法、上样量、抗体稀释比例、孵育时间和显色方法。 阅读提示：Methods 2.3.8 |
| 统计分析 | 样本量n=3；数据以均数±标准差表示；单因素方差分析及事后检验方法（LSD-t或Welch检验）。 阅读提示：Methods 2.4 |
