单细胞转录组图谱构建
解析三种动脉移植物的细胞组成和异质性。
对ITA、RA、RGA各3个样本进行scRNA-seq，经质量控制、批次校正、聚类和细胞类型注释。
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单细胞水平动脉移植物优化策略
Strategies for arterial graft optimization at the single-cell level
实验完整度
高包含scRNA-seq、体外细胞实验（qPCR、免疫染色、划痕实验）、小鼠颈动脉结扎模型及免疫荧光验证等多层级证据，且具有功能验证和机制验证。
主要模型
人胸廓内动脉、桡动脉、胃网膜右动脉移植物 人原代血管平滑肌细胞 人原代血管外膜成纤维细胞 部分颈动脉结扎小鼠模型
重点核对
样本类型：ITA（n=7）、RA（n=7）、RGA（n=3） ISO-1给药剂量：10 mg kg-1和30 mg kg-1腹腔注射，每日一次，持续3周 细胞处理：VSMCs用100 ng ml-1 MIF和/或50 µmol ISO-1处理24小时 成纤维细胞处理：GDF10（10 ng ml-1和50 ng ml-1）或ICG-001（HY-14428）处理24小时
摘要
冠状动脉旁路移植术中常用的动脉移植物包括胸廓内动脉（ITA）、桡动脉（RA）和胃网膜右动脉（RGA）；其中，ITA的临床预后最好。本研究通过分析不同动脉移植物的单细胞转录组，以ITA为参照，提出了针对RA和RGA的优化策略。与ITA相比，RA具有更多与脂质处理相关的CD36+内皮细胞。RGA的血管平滑肌细胞更易发生痉挛，其次是RA；与ITA比较提示钾通道开放剂可能对抗血管痉挛。RA和RGA的成纤维细胞分别高表达GDF10和CREB5；两者均与细胞外基质沉积相关。细胞间通讯分析显示，RA中巨噬细胞迁移抑制因子信号水平较高。对部分颈动脉结扎小鼠给予巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂，可阻断扰动流诱导的新生内膜增生。调节已识别的靶点可能对动脉移植物具有保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过单细胞转录组分析识别不同动脉移植物（ITA、RA和RGA）的细胞组成和功能差异，并据此提出优化策略？
- 核心机制
- RA中MIF高表达通过SMAD信号通路上调有丝分裂相关基因，促进VSMC增殖和新生内膜增生；RGA和RA的成纤维细胞分别通过CREB5和GDF10促进细胞外基质沉积和纤维化；RGA和RA的VSMC痉挛倾向与KCNMA1等收缩相关基因高表达有关。
- 主要证据
- scRNA-seq揭示RA富集CD36+内皮细胞和MIF+VSMC；RGA的VSMC收缩相关基因评分最高；GDF10和CREB5在成纤维细胞中高表达并促进纤维化；小鼠部分颈动脉结扎模型中ISO-1抑制新生内膜增生；体外实验证实MIF促进VSMC增殖且被ISO-1逆转。
- 研究意义
- 本研究提出的策略包括：抑制MIF以减少RA的新生内膜增生，钾通道开放剂可能对抗RGA的血管痉挛，抑制CREB5和GDF10以减少细胞外基质沉积和纤维化，从而改善CABG预后。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
内皮细胞亚型分析
比较三种动脉移植物中内皮细胞亚型的组成和功能差异，重点评估脂质处理、血管舒缩和药物靶点表达。
对内皮细胞进行再聚类，分析亚型比例、差异表达基因、基因集富集评分，并验证LDLR等蛋白表达。
血管平滑肌细胞功能评估
比较VSMC亚型组成和功能，评估收缩、痉挛和增殖潜力。
对VSMC进行亚型分析，计算收缩功能、力学感知等基因集评分，检测药物靶点表达，并用免疫荧光验证KCNMA1等。
成纤维细胞纤维化倾向评估
比较成纤维细胞亚型及其促纤维化或抗纤维化潜力。
对成纤维细胞进行亚型分析，检测ECM相关基因表达，并验证GDF10和CREB5的功能。
免疫微环境分析
比较三种动脉移植物中免疫细胞组成和功能。
对免疫细胞进行亚型分析，比较组成差异，进行GO富集分析，并检测T细胞活化相关基因表达。
细胞间通讯分析
识别RA中与新生内膜增生相关的信号通路。
使用CellChat分析细胞间相互作用，发现MIF通路在RA中上调。
体内验证MIF抑制效果
验证MIF抑制剂ISO-1对血流紊乱诱导的新生内膜增生的抑制作用。
建立部分颈动脉结扎小鼠模型，给予ISO-1或生理盐水3周，超声和病理检测内膜增生。
体外验证MIF促进VSMC增殖
验证MIF直接促进VSMC增殖及其机制。
培养原代VSMC，MIF刺激或MIF+ISO-1处理，检测Ki67阳性率，转录组测序分析差异基因和通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离与细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11885084 |
| 胎牛血清 | Corning | 35-076-CV | |
| 组织解离 | II型胶原酶 | Worthington | LS004176 |
| 40微米细胞筛网 | Falcon | 352340 | |
| 免疫组化 | EDTA抗原修复液 | ZSBG-BIO | ZLI-9068 |
| 山羊血清 | ZSBG-BIO | ZLI-9056 | |
| 抗兔HRP | ZSBG-BIO | PV-6001 | |
| 抗鼠HRP | ZSBG-BIO | PV-6002 | |
| 多重免疫荧光 | Opal 7多重免疫荧光检测 | PerkinElmer | -- |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab28364 | |
| 抗CD36抗体 | Abcam | ab133625 | |
| 抗αSMA抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 抗VIM抗体 | Abcam | ab8978 | |
| 抗PTGS2抗体 | Abcam | ab15191 | |
| 抗LDLR抗体 | Abcam | ab52818 | |
| 抗SEMA3G抗体 | OriGENE | AP53845PU-N | |
| 抗KCNMA1抗体 | Alomone | APC-021 | |
| 抗CACNA1C抗体 | Abcam | ab84814 | |
| 抗CTHRC1抗体 | Abcam | ab85739 | |
| 抗GDF10抗体 | Abcam | ab235005 | |
| 抗MIF抗体 | Proteintech | 20415-1-AP | |
| 抗SMAD2抗体 | Proteintech | 12570-1-AP | |
| 抗SMAD5抗体 | Proteintech | 12167-1-AP | |
| Vectra 3成像系统 | -- | -- | |
| scRNA-seq | Chromium单细胞控制器 | 10x Genomics | -- |
| 单细胞5' PE（v.1.1） | 10x Genomics | -- | |
| C1000 Touch热循环仪 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| SPRIselect试剂盒 | Beckman Coulter | -- | |
| Agilent Bioanalyzer高灵敏度试剂盒 | Agilent | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Pricella | CM-P167 |
| 人原代血管平滑肌细胞 | Pricella | CP-H167 | |
| 人原代血管外膜成纤维细胞 | Pricella | CP-H200 | |
| 细胞处理 | MIF重组蛋白 | MedChemExpress | HY-P7387 |
| ISO-1 | MedChemExpress | HY-16692 | |
| GDF10重组蛋白 | MedChemExpress | HY-P7332 | |
| ICG-001 | MedChemExpress | HY-14428 | |
| 划痕实验和细胞免疫荧光 | Axio Observer D1显微镜 | ZEISS | -- |
| 细胞免疫荧光 | 96孔黑色平底板 | Corning | 3916 |
| 抗COL1A1抗体 | Abcam | ab138492 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| Operetta CLS高内涵分析系统 | PerkinElmer | -- | |
| RNA提取与qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| qPCR | QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| PowerTrack SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A46109 | |
| 转录组测序 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | -- | |
| Illumina NovaSeq平台 | Illumina | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | Charles River Laboratories | -- |
| Vevo 2100超声系统 | VisualSonics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞测序 | 样本类型：ITA、RA、RGA各3例；组织处理：酶解时间、细胞悬液制备；质量控制参数：基因计数<15,000，基因数200-4,000，线粒体基因比例<15%，核糖体基因比例<15% 阅读提示：Methods: scRNA-seq, 组织处理, 预处理 |
| 血管平滑肌细胞培养与处理 | 细胞来源：人原代VSMCs（Pricella），传代3-5；处理：MIF 100 ng ml-1，ISO-1 50 µmol，处理24小时 阅读提示：Methods: Primary culture of VSMCs |
| 成纤维细胞培养与处理 | 细胞来源：人原代血管外膜FBs（Pricella），传代3-6；处理：GDF10（10-50 ng ml-1）或ICG-001（HY-14428），处理24小时 阅读提示：Methods: Primary culture of vascular adventitial FBs |
| 动物模型 | 小鼠品系：12周龄野生型雄性C57BL/6；手术：部分颈动脉结扎（对左颈总动脉的3个分支结扎，保留甲状腺上动脉）；给药：ISO-1 10或30 mg kg-1腹腔注射，每日一次，持续3周 阅读提示：Methods: Animal model, Fig. 7d |
| 免疫荧光和免疫组化 | 抗体：CD31、CD36、αSMA、VIM、PTGS2、LDLR、SEMA3G、KCNMA1、CACNA1C、CTHRC1、GDF10、MIF、SMAD2、SMAD5；稀释比例需核对 阅读提示：Methods: Multiplex immunofluorescence |