鉴定衰老相关免疫细胞亚群
确定BAT中随年龄增长的免疫细胞类型及其特征
重新分析年轻和老年大鼠BAT的scRNA-seq数据，发现T细胞和中性粒细胞比例增加，S100A8表达显著升高，并鉴定为促炎和衰老表型。
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衰老过程中衰老免疫细胞积累促进棕色脂肪组织功能障碍
Senescent immune cells accumulation promotes brown adipose tissue dysfunction during aging.
实验完整度
高包含单细胞测序分析、细胞示踪、骨髓嵌合小鼠、基因敲低/过表达、异种移植及药物干预等独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠 NOD-SCID小鼠 S100a8-Cre-EGFP报告小鼠 C3H10T1/2棕色脂肪细胞
重点核对
S100A8+免疫细胞的鉴定与来源（骨髓来源） S100A8对棕色脂肪细胞RBM3表达的抑制作用及其机制 RBM3通过稳定Nrp1和Epha7 mRNA调控轴突导向的机制 paquinimod对老年小鼠BAT功能及代谢紊乱的改善作用
摘要
棕色脂肪组织（BAT）介导的产热随年龄增长而下降。然而，其潜在机制仍不清楚。在此，我们揭示骨髓来源的促炎和衰老的S100A8+免疫细胞（主要是T细胞和中性粒细胞）在衰老过程中侵入雄性大鼠和小鼠的BAT。这些S100A8+免疫细胞与脂肪细胞和交感神经偶联，损害轴突网络。机制上，这些衰老免疫细胞分泌大量S100A8以抑制脂肪RNA结合基序蛋白3表达。这种下调导致轴突导向相关基因失调，导致交感神经支配和产热功能受损。异种移植实验表明，人类S100A8+免疫细胞浸润小鼠BAT，足以诱导衰老样BAT功能障碍。值得注意的是，用S100A8抑制剂paquinimod治疗可恢复老年雄性小鼠的BAT轴突网络和产热功能。我们的研究表明，靶向骨髓来源的衰老免疫细胞为改善BAT衰老和相关代谢紊乱提供了一条途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老过程中棕色脂肪组织功能障碍的潜在机制是什么？
- 核心机制
- 骨髓来源的促炎和衰老S100A8+免疫细胞在BAT中积聚，分泌S100A8，通过TLR4-p38轴抑制棕色脂肪细胞中RNA结合蛋白RBM3的表达，导致轴突导向基因（如Nrp1、Epha7）失调，损害交感神经支配和产热功能。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq分析、细胞示踪、骨髓嵌合小鼠、基因敲低/过表达、异种移植和药物干预等实验，证实S100A8+免疫细胞的作用及机制。
- 研究意义
- 靶向骨髓来源的S100A8+衰老免疫细胞或应用S100A8抑制剂paquinimod，可能为改善BAT衰老和相关代谢紊乱提供治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证S100A8+免疫细胞的骨髓来源
证明BAT浸润的S100A8+免疫细胞来源于骨髓
通过PKH26标记细胞示踪、S100a8-Cre-EGFP报告小鼠和骨髓嵌合小鼠实验，证实S100A8+免疫细胞优先迁移至BAT。
评估S100A8+免疫细胞对BAT功能的影响
确定S100A8+免疫细胞是否足以损害BAT产热功能
将S100A8+免疫细胞转移至年轻小鼠，检测产热基因表达、能量消耗、核心体温及脂滴大小，并进行S100a8敲低实验。
研究S100A8对棕色脂肪细胞的作用机制
探索S100A8如何影响棕色脂肪细胞功能
用S100A8处理棕色脂肪细胞，进行RNA-seq筛选靶基因，验证TLR4介导的信号通路，并鉴定RBM3为下调基因。
验证RBM3在BAT中的功能
确定RBM3缺失是否导致交感神经支配和产热功能受损
通过AAV-shRNA在BAT中敲低Rbm3，检测交感神经标志物、产热基因表达和冷应激反应。
构建RBM3过表达模型并验证其拯救效果
验证RBM3过表达能否逆转S100A8+免疫细胞引起的BAT功能障碍
在2月龄小鼠BAT中过表达RBM3，并转移S100A8+免疫细胞，检测交感神经支配、产热功能和衰老标志物。
解析RBM3调控交感神经支配的分子机制
确定RBM3调控轴突导向基因的具体分子机制
通过RIP-seq和RNA-seq鉴定RBM3直接结合的靶基因，验证RBM3对Nrp1和Epha7 mRNA稳定性的调控，并在共培养体系中验证功能。
异种移植人类S100A8+免疫细胞验证其致病性
评估人类S100A8+免疫细胞是否能在小鼠中诱导BAT衰老
从老年供体分离S100A8+免疫细胞，转移至NOD-SCID小鼠，检测BAT浸润、交感神经支配和产热功能。
验证paquinimod对BAT衰老和代谢紊乱的作用
测试S100A8抑制剂paquinimod能否改善老年小鼠的BAT功能
给予老年小鼠paquinimod处理，检测BAT中S100A8+免疫细胞浸润、交感神经支配、产热功能及整体代谢指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与分化 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Solarbio | -- | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma | I5879 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| 胰岛素 | Sigma | 91077C | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | MedChem Express | HY-A0070A | |
| 吲哚美辛 | Sigma | I7378 | |
| 罗格列酮 | MedChem Express | HY-17386 | |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Sigma | L4391 |
| 重组小鼠S100A8蛋白 | SinoBiological | 50228-M07E | |
| 重组小鼠S100A9蛋白 | BioLegend | 765402 | |
| 神经生长因子 | Peprotech | -- | |
| 药物处理 | 帕奎莫德 | MedChem Express | HY-100442 |
| 动物实验 | PKH26细胞标记染料 | Sigma | CGLDIL |
| AAV-Fabp4-RBM3病毒 | GeneChem | -- | |
| AAV-Fabp4-ShRbm3病毒 | GeneChem | -- | |
| AAV-ShS100a8病毒 | GeneChem | -- | |
| 流式细胞术 | Zombie Aqua™可固定活性染料 | BioLegend | 423102 |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 101320 | |
| Alexa Fluor 555偶联抗兔二抗 | Invitrogen | A21428 | |
| Alexa Fluor 647偶联抗兔二抗 | Invitrogen | A32795 | |
| APC-Cy7抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103116 | |
| FITC抗人/小鼠CD11b抗体 | BioLegend | 101206 | |
| Percp-Cy5.5抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100328 | |
| PE抗人CD45抗体 | BioLegend | 304007 | |
| FITC抗小鼠谱系混合物 | BioLegend | 133302 | |
| APC-Sca-1抗体 | BioLegend | 108111 | |
| BV421抗小鼠c-kit抗体 | BioLegend | 105827 | |
| 抗人/小鼠S100A8抗体 | Proteintech | 15792-1-AP | |
| S100A9抗体 | Proteintech | 26992-1-AP | |
| 生物素抗人CD3抗体 | BioLegend | 317319 | |
| Percp/Cyanine5.5链霉亲和素 | BioLegend | 405214 | |
| PE抗小鼠CD62L抗体 | BioLegend | 104407 | |
| PE抗小鼠CXCR2抗体 | BioLegend | 149303 | |
| APC抗小鼠CXCR4抗体 | BioLegend | 146507 | |
| 免疫荧光 | CD11b抗体 | BioLegend | 101245 |
| CD3抗体 | BioLegend | 100203 | |
| 酪氨酸羟化酶抗体 | GeneTex | GTX634481 | |
| 酪氨酸羟化酶抗体 | Beyotime | AF2185 | |
| TUBB3抗体 | Cell Signaling Technology | 4466S | |
| EGFP抗体 | Servicebio | GB11602 | |
| CD31抗体 | Servicebio | GB12063 | |
| Alexa Fluor 488偶联抗兔二抗 | Invitrogen | A21206 | |
| Alexa Fluor 555偶联抗小鼠二抗 | Invitrogen | A31570 | |
| 蛋白质印迹 | RBM3抗体 | Proteintech | 14363-1-AP |
| PGC1a (4A8) 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-517380 | |
| UCP1抗体 | Abcam | ab10983 | |
| P21抗体 | Abcam | ab109520 | |
| P16抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4500072 | |
| Tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| p-p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511S | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690S | |
| p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695S | |
| GAPDH抗体 | Origene | TA802519 | |
| NRP1(A-12)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5307 | |
| EPHA7抗体 | Affinity Biosciences | AF0627 | |
| 磷酸化TH (Ser40) 抗体 | Cell Signaling Technology | 2791S | |
| 磷酸化组蛋白H2A.X (Ser139) 抗体 | Sigma | 05-636 | |
| PCNA抗体 | Boster | BM0104 | |
| SA-β-gal染色 | 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9860 |
| ELISA | S100A8 ELISA试剂盒 | Abnova | KA5087 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Servicebio | GEM0004 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Servicebio | GEM0001 | |
| 流式细胞分选 | BD FACS Aria流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式细胞分析 | BD FACS Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 代谢监测 | 综合实验室动物监测系统 | Columbus Instruments | -- |
| 细胞培养 | C3H10T1/2细胞系 | Procell | CL-0325 |
| PC12细胞系 | Procell | CL-0480 | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Life Technology | -- |
| Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别（雄性）及饲养环境 阅读提示：Methods - Animals |
| 细胞转移实验 | S100A8+免疫细胞的分选纯度、转移数量、转移途径及分析时间点 阅读提示：Methods - Adoptive transfer of S100A8+ immune cells and GFP+ immune cells |
| 药物处理 | paquinimod的剂量、给药方式、频率和持续时间 阅读提示：Methods - In vivo protein and compound treatments |
| 冷暴露实验 | 环境温度、监测时间点和核心体温测量方法 阅读提示：Methods - Cold exposure studies |
| BAT基因操作 | AAV血清型、启动子、注射剂量和注射方式 阅读提示：Methods - Intra-BAT injection of adeno-associated virus |