建立衰老模型
建立D-半乳糖诱导的体内外衰老模型,以模拟衰老相关的记忆障碍。
体外使用75 mM D-半乳糖处理HT22细胞2天;体内对4月龄雄性ICR小鼠每日腹腔注射150 mg/kg D-半乳糖,持续6周。
Circ-Vps41 positively modulates Syp and its overexpression improves memory ability in aging mice.
实验包含体外细胞模型(HT22细胞衰老模型)、体内动物模型(D-半乳糖诱导的衰老ICR小鼠),并进行了功能验证(行为学、树突棘密度)和机制验证(双荧光素酶报告基因、FISH、rescue实验)。
HT22细胞衰老模型 D-半乳糖诱导的衰老ICR小鼠模型
D-半乳糖处理浓度和时间:体外75 mM处理2天;体内150 mg/kg每天,持续6周 circ-Vps41过表达方式:AAV-circ-Vps41立体定位注射至海马CA1区域(1 μl,0.1 μl/min) siRNA转染浓度:si-circ-Vps41最终浓度40 nM/孔 miR-24-3p mimics共转染实验 行为学测试时间点:ORT在训练后2小时和24小时;MWM训练5天,第7天探查
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立D-半乳糖诱导的体内外衰老模型,以模拟衰老相关的记忆障碍。
体外使用75 mM D-半乳糖处理HT22细胞2天;体内对4月龄雄性ICR小鼠每日腹腔注射150 mg/kg D-半乳糖,持续6周。
验证circ-Vps41在衰老模型中的表达变化。
通过qRT-PCR检测细胞和小鼠海马组织中circ-Vps41的表达水平。
探讨circ-Vps41过表达是否改善衰老小鼠的突触可塑性和学习记忆能力。
通过立体定位注射AAV-circ-Vps41至小鼠海马CA1区,检测树突棘密度(Golgi-Cox染色)、Syp表达(western blot、qRT-PCR、免疫组化)以及行为学表现(ORT、MWM)。
验证circ-Vps41在体外能否调控Syp表达。
在HT22细胞中通过质粒过表达或siRNA敲低circ-Vps41,检测Syp的蛋白和mRNA水平。
验证circ-Vps41是否作为miR-24-3p的海绵。
通过双荧光素酶报告基因实验检测circ-Vps41与miR-24-3p的结合,并通过FISH检测两者在脑组织中的共定位。
验证miR-24-3p是否直接靶向Syp mRNA 3'UTR。
通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-24-3p与Syp 3'UTR的结合,并在HT22细胞中过表达miR-24-3p,检测Syp表达。
证实circ-Vps41通过miR-24-3p上调Syp,并改善衰老细胞的Syp表达。
在D-半乳糖处理的HT22细胞中共转染circ-Vps41过表达质粒和miR-24-3p mimics,检测Syp表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Procell | PM150210 |
| 胎牛血清 | Clark Bioscience | FB25015 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| 衰老模型建立 | D-半乳糖 | TCI | G0008 |
| 衰老检测 | 衰老细胞染色试剂盒 | Solarbio | G1580 |
| RT-qPCR | 动物组织/细胞总RNA提取试剂盒 | ZOMANBIO | ZP404 |
| HiScript III逆转录预混液(qPCR) | Vazyme | R323 | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | KT201 | |
| QuantStudio™ 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | 4484642 | |
| miRNA检测 | miRcute miRNA提取试剂盒 | Tiangen | DP501 |
| miRcute Plus miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | TIANGEN | KR211 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0020 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| 5×上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| 兔抗PSD95抗体 | Abcam | ab18258 | |
| 兔抗β-actin抗体 | ABclonal | AC026 | |
| Western blot检测 | Odyssey成像系统 | LI-COR Biosciences | 987-07708 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 病毒注射 | 微量注射系统 | KD Scientific | 78-1311Q |
| Golgi-Cox染色 | Golgi-Cox染色试剂盒 | GenMed | GMS80020.1 |
| 振动切片机 | Leica | VT100S | |
| 免疫组化 | SP-9001检测试剂盒 | ZSGBBIO | SP-9001 |
| RNA FISH | RNA FISH试剂盒 | EXONBIO | D-2922B |
| RNA FISH试剂盒 | RiBo | C10910 | |
| 荧光成像 | 共聚焦显微镜 | Olympus | FV1000 |
| 光学成像 | 光学显微镜 | Leica | DM2000 LED |
| 蛋白浓度测定 | Infinite F200酶标仪 | TECAN | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 衰老模型建立 | D-半乳糖浓度(体外75 mM,体内150 mg/kg)和处理时间(体外2天,体内6周) 阅读提示:Methods: Establishment of an HT22 senescent cell model 和 Animal model |
| circ-Vps41过表达 | AAV-circ-Vps41注射剂量(1 μl)、速率(0.1 μl/min)和注射坐标(前囟后1.89 mm,侧2.29 mm,腹侧1.65 mm) 阅读提示:Methods: Virus stereotaxic injections |
| Syp表达检测 | Syp抗体(western blot 1:2000,免疫组化1:300)和蛋白上样量(30 μg) 阅读提示:Methods: Western blot 和 Immunohistochemical staining |
| 行为学测试 | ORT在训练后2和24小时进行;MWM训练5天,每天4次试次,第7天探查 阅读提示:Methods: Object recognition test 和 Morris water maze task |
| 双荧光素酶报告基因 | 293A细胞共转染miR-24-3p mimics和野生型或突变型靶序列报告载体,培养24小时 阅读提示:Methods: Dual-luciferase reporter assay |