Circ-Vps41正向调节Syp,其过表达改善衰老小鼠的记忆能力

Circ-Vps41 positively modulates Syp and its overexpression improves memory ability in aging mice.

作者信息Yibo Li, Hongfang Wang, Yanjing Gao, Runjiao Zhang, Qing Liu, Wenmeng Xie, Ziyu Liu, Dandan Geng, Lei Wang
PMID36533129
发布时间2022-12-15
DOI10.3389/fnmol.2022.1037912

实验完整度

实验包含体外细胞模型(HT22细胞衰老模型)、体内动物模型(D-半乳糖诱导的衰老ICR小鼠),并进行了功能验证(行为学、树突棘密度)和机制验证(双荧光素酶报告基因、FISH、rescue实验)。

主要模型

HT22细胞衰老模型 D-半乳糖诱导的衰老ICR小鼠模型

重点核对

D-半乳糖处理浓度和时间:体外75 mM处理2天;体内150 mg/kg每天,持续6周 circ-Vps41过表达方式:AAV-circ-Vps41立体定位注射至海马CA1区域(1 μl,0.1 μl/min) siRNA转染浓度:si-circ-Vps41最终浓度40 nM/孔 miR-24-3p mimics共转染实验 行为学测试时间点:ORT在训练后2小时和24小时;MWM训练5天,第7天探查

摘要

背景:年龄是神经退行性疾病的既定风险因素。与衰老相关的认知衰退是老年人记忆障碍的常见原因,其中海马突触可塑性和海马依赖性记忆形成受损。环状RNA(circRNAs)在许多认知障碍中已有报道,但其在与衰老相关的记忆障碍中的作用尚不清楚。方法:在本研究中,我们旨在探讨circ-Vps41对衰老相关海马依赖性记忆障碍的影响,并探索其潜在机制。这里,使用D-半乳糖建立常规衰老模型,导致记忆功能障碍。结果:circ-Vps41在D-半乳糖诱导的体内外衰老中显著下调。过表达circ-Vps41可上调突触素(Syp),从而促进突触可塑性并减轻衰老小鼠的认知障碍。机制上,我们发现circ-Vps41通过物理结合miR-24-3p上调Syp表达。此外,miR-24-3p模拟物逆转了circ-Vps41过表达诱导的Syp表达增加。讨论:过表达circ-Vps41通过miR-24-3p/Syp轴减轻了突触可塑性和记忆功能障碍。这些发现揭示了circ-Vps41调控网络,并为其改善衰老相关学习记忆障碍的潜在机制提供了新见解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
circ-Vps41在衰老相关记忆障碍中的作用及其潜在机制是否通过调节Syp表达来影响学习记忆?
核心机制
circ-Vps41通过海绵吸附miR-24-3p,上调Syp表达,从而促进突触可塑性,改善衰老小鼠的学习记忆能力。
主要证据
在D-半乳糖诱导的体内外衰老模型中,circ-Vps41表达下调;过表达circ-Vps41增加Syp表达和树突棘密度,并改善行为学表现;双荧光素酶报告基因验证了circ-Vps41与miR-24-3p、miR-24-3p与Syp 3'UTR的直接结合;miR-24-3p mimics可部分逆转circ-Vps41过表达对Syp上调的作用。
研究意义
研究为理解衰老相关记忆障碍的分子病理机制提供了新参考,并可能为改善衰老相关记忆障碍提供潜在的治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立衰老模型

建立D-半乳糖诱导的体内外衰老模型,以模拟衰老相关的记忆障碍。

体外使用75 mM D-半乳糖处理HT22细胞2天;体内对4月龄雄性ICR小鼠每日腹腔注射150 mg/kg D-半乳糖,持续6周。

2

检测衰老模型中的circ-Vps41表达

验证circ-Vps41在衰老模型中的表达变化。

通过qRT-PCR检测细胞和小鼠海马组织中circ-Vps41的表达水平。

3

过表达circ-Vps41并观察对突触可塑性和记忆的影响

探讨circ-Vps41过表达是否改善衰老小鼠的突触可塑性和学习记忆能力。

通过立体定位注射AAV-circ-Vps41至小鼠海马CA1区,检测树突棘密度(Golgi-Cox染色)、Syp表达(western blot、qRT-PCR、免疫组化)以及行为学表现(ORT、MWM)。

4

体外验证circ-Vps41对Syp的调控

验证circ-Vps41在体外能否调控Syp表达。

在HT22细胞中通过质粒过表达或siRNA敲低circ-Vps41,检测Syp的蛋白和mRNA水平。

5

验证circ-Vps41与miR-24-3p的直接结合

验证circ-Vps41是否作为miR-24-3p的海绵。

通过双荧光素酶报告基因实验检测circ-Vps41与miR-24-3p的结合,并通过FISH检测两者在脑组织中的共定位。

6

验证miR-24-3p对Syp的直接调控

验证miR-24-3p是否直接靶向Syp mRNA 3'UTR。

通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-24-3p与Syp 3'UTR的结合,并在HT22细胞中过表达miR-24-3p,检测Syp表达。

7

Rescue实验验证机制链路

证实circ-Vps41通过miR-24-3p上调Syp,并改善衰老细胞的Syp表达。

在D-半乳糖处理的HT22细胞中共转染circ-Vps41过表达质粒和miR-24-3p mimics,检测Syp表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基ProcellPM150210
胎牛血清Clark BioscienceFB25015
青霉素/链霉素溶液----
胰蛋白酶----
CCK-8试剂盒BeyotimeC0037
D-半乳糖TCIG0008
衰老细胞染色试剂盒SolarbioG1580
动物组织/细胞总RNA提取试剂盒ZOMANBIOZP404
HiScript III逆转录预混液(qPCR)VazymeR323
ChamQ通用SYBR qPCR预混液VazymeKT201
QuantStudio™ 6 Flex实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems4484642
miRcute miRNA提取试剂盒TiangenDP501
miRcute Plus miRNA第一链cDNA合成试剂盒TIANGENKR211
RIPA裂解液SolarbioR0020
BCA蛋白定量试剂盒SolarbioPC0020
5×上样缓冲液SolarbioP1040
兔抗PSD95抗体Abcamab18258
兔抗β-actin抗体ABclonalAC026
Odyssey成像系统LI-COR Biosciences987-07708
Lipofectamine 3000转染试剂Thermo Fisher ScientificL3000015
微量注射系统KD Scientific78-1311Q
Golgi-Cox染色试剂盒GenMedGMS80020.1
振动切片机LeicaVT100S
SP-9001检测试剂盒ZSGBBIOSP-9001
RNA FISH试剂盒EXONBIOD-2922B
RNA FISH试剂盒RiBoC10910
共聚焦显微镜OlympusFV1000
光学显微镜LeicaDM2000 LED
Infinite F200酶标仪TECAN--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
衰老模型建立
D-半乳糖浓度(体外75 mM,体内150 mg/kg)和处理时间(体外2天,体内6周)
阅读提示:Methods: Establishment of an HT22 senescent cell model 和 Animal model
circ-Vps41过表达
AAV-circ-Vps41注射剂量(1 μl)、速率(0.1 μl/min)和注射坐标(前囟后1.89 mm,侧2.29 mm,腹侧1.65 mm)
阅读提示:Methods: Virus stereotaxic injections
Syp表达检测
Syp抗体(western blot 1:2000,免疫组化1:300)和蛋白上样量(30 μg)
阅读提示:Methods: Western blot 和 Immunohistochemical staining
行为学测试
ORT在训练后2和24小时进行;MWM训练5天,每天4次试次,第7天探查
阅读提示:Methods: Object recognition test 和 Morris water maze task
双荧光素酶报告基因
293A细胞共转染miR-24-3p mimics和野生型或突变型靶序列报告载体,培养24小时
阅读提示:Methods: Dual-luciferase reporter assay