检测NEAT1和BHLHE40在CRC组织和细胞中的表达
明确NEAT1和BHLHE40在CRC中的表达水平，验证其在肿瘤组织中的上调。
通过UALCAN数据库分析COAD和READ中NEAT1表达，RT-qPCR检测54对CRC组织及癌旁组织、CRC细胞系和HCoEpiC细胞中NEAT1和BHLHE40的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
长链非编码RNA NEAT1由BHLHE40诱导激活Wnt/β-catenin信号通路并促进结直肠癌进展
Long non-coding RNA NEAT1 induced by BHLHE40 activates Wnt/β-catenin signaling and potentiates colorectal cancer progression.
实验完整度
高包含体外细胞实验（RT-qPCR、双荧光素酶、ChIP、MTT、Transwell、Western blot、流式）、体内动物实验（皮下及尾静脉模型，HE、免疫组化）及机制验证，且进行回补实验，证据层级独立。
主要模型
人结直肠癌细胞系LoVo、HCT-15 人结肠上皮细胞HCoEpiC BALB/C裸鼠皮下移植瘤模型 BALB/C裸鼠尾静脉肺转移模型
重点核对
NEAT1和BHLHE40在CRC组织和细胞中的表达水平（RT-qPCR） BHLHE40与NEAT1启动子结合及转录调控（双荧光素酶、ChIP） sh-BHLHE40和oe-NEAT1的感染效率及对细胞功能的影响（MTT、Transwell、流式） 体内肿瘤生长和肺转移实验的动物分组及处理（每组6只裸鼠，皮下或尾静脉注射） Wnt/β-catenin通路活性（TOP/FOP flash、Western blot）及iCRT3处理（75 μM，24 h）
摘要
背景：核富集丰富转录本1（NEAT1）是一种长链非编码RNA（lncRNA），已被证明与结直肠癌（CRC）的进展有关。然而，其上游机制尚未得到充分研究。在本研究中，我们探讨了NEAT1在CRC中的功能和机制。方法：通过RT-qPCR分析CRC组织和CRC细胞中NEAT1的表达。从UALCAN获得与NEAT1共表达的基因，并与hTFtarget中靶向NEAT1的转录因子取交集。采用双荧光素酶实验、RT-qPCR和ChIP分析BHLHE40与NEAT1之间的转录调控关系。敲低BHLHE40并过表达NEAT1的LoVo和HCT-15细胞用于MTT、Transwell、Western blot和流式细胞术以检测CRC细胞的恶性侵袭能力。在小鼠中通过HE和免疫组化分析研究敲低BHLHE40和过表达NEAT1对肿瘤和肺转移的影响。结果：NEAT1和BHLHE40在CRC组织和细胞中显著过表达。BHLHE40与NEAT1启动子存在结合关系。敲低BHLHE40在体外逆转了恶性表型，并在体内减缓了肿瘤生长和转移扩散，这些效应可被NEAT1过表达所逆转。BHLHE40过表达增加了Wnt/β-catenin通路活性，而敲低NEAT1降低了Wnt/β-catenin通路活性。结论：BHLHE40介导NEAT1的转录激活，进而激活Wnt/β-catenin通路并促进CRC进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NEAT1在结直肠癌中的上游调控机制及其对CRC进展的功能和机制是什么？
- 核心机制
- BHLHE40作为转录因子直接结合NEAT1启动子，转录激活NEAT1，进而激活Wnt/β-catenin信号通路，促进CRC细胞增殖、迁移、侵袭及EMT。
- 主要证据
- 通过UALCAN和hTFtarget预测及RT-qPCR验证NEAT1和BHLHE40高表达；双荧光素酶和ChIP证实BHLHE40结合NEAT1启动子；体外敲低BHLHE40抑制恶性表型，NEAT1过表达逆转；体内实验显示sh-BHLHE40抑制肿瘤生长和肺转移，oe-NEAT1逆转；Western blot和TOP/FOP flash显示BHLHE40激活Wnt/β-catenin，NEAT1敲低减弱该激活。
- 研究意义
- 揭示BHLHE40/NEAT1/Wnt-β-catenin轴在CRC EMT中的分子机制，并提示BHLHE40和NEAT1可作为CRC治疗的潜在分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预测并验证BHLHE40对NEAT1的转录调控
验证BHLHE40是否直接结合NEAT1启动子并促进其转录。
利用UALCAN获得与NEAT1共表达基因与hTFtarget预测的转录因子取交集，筛选BHLHE40；在LoVo和HCT-15细胞中敲低BHLHE40，检测NEAT1表达；双荧光素酶报告基因和ChIP实验验证BHLHE40与NEAT1启动子的结合。
体外功能回补实验验证NEAT1介导BHLHE40的作用
验证敲低BHLHE40对CRC细胞恶性表型的抑制作用是否通过NEAT1介导。
在LoVo和HCT-15细胞中敲低BHLHE40并过表达NEAT1，进行MTT、Transwell（迁移和侵袭）、Western blot（EMT标记物）及流式细胞术（凋亡）检测。
体内实验验证BHLHE40-NEAT1对肿瘤生长和转移的调控
评估敲低BHLHE40和过表达NEAT1对体内肿瘤生长和肺转移的影响。
将感染sh-NC、sh-BHLHE40、sh-BHLHE40+oe-NC、sh-BHLHE40+oe-NEAT1的HCT-15细胞皮下注射或尾静脉注射入BALB/C裸鼠，观察肿瘤生长曲线，4周或24天后取肿瘤和肺组织进行HE染色和免疫组化（Ki67、BHLHE40）及Western blot检测EMT标记物。
验证BHLHE40-NEAT1激活Wnt/β-catenin通路
验证BHLHE40通过NEAT1激活Wnt/β-catenin信号通路，并介导促癌功能。
在CRC细胞中过表达BHLHE40并敲低NEAT1，Western blot检测Wnt、β-catenin、c-myc、cyclin D1及EMT蛋白；用TOP/FOP flash检测通路活性；用Wnt/β-catenin抑制剂iCRT3处理，检测细胞活力、迁移、侵袭和凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | WheLab | M0101A |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| iCRT3 | Selleck | S8647 | |
| 细胞增殖检测 | MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒 | Beijing Solarbio Life Sciences | M1020 |
| 细胞迁移和侵袭 | 基质胶 | -- | -- |
| 结晶紫 | Sangon Biotech | A100528 | |
| 流式细胞术 | 膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Sangon | E606336 |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| BHLHE40抗体 | ProteinTech Group | 17895-1-AP | |
| Wnt抗体 | ProteinTech Group | 27935-1-AP | |
| β-catenin抗体 | ProteinTech | 17565-1-AP | |
| 细胞周期蛋白D1抗体 | ProteinTech | 26939-1-AP | |
| c-myc抗体 | GeneTex | GTX103436 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | GeneTex | GTX100443 | |
| N-钙黏蛋白抗体 | GeneTex | GTX127345 | |
| 波形蛋白抗体 | GeneTex | GTX100619 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sangon | D110001 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | GeneTex | GTX213110-01 | |
| ECL化学发光系统 | -- | -- | |
| RT-qPCR | Trizol总RNA提取试剂 | Tansoole | -- |
| miRNeasy FFPE试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 逆转录试剂盒 | Tansoole | 041088841 | |
| 探针法荧光PCR预混液 | Tansoole | 041093363 | |
| 双荧光素酶实验 | pGL3-Basic荧光素酶载体 | Miaolingbio | P32227 |
| 双荧光素酶检测试剂盒 | Thermo Fisher | 16186 | |
| TOP flash荧光素酶报告质粒 | Beyotime | D2501 | |
| FOP flash质粒 | Beyotime | D2503 | |
| 脂质体转染试剂2000 | Thermo Fisher | -- | |
| ChIP实验 | ChIP检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 17-295 |
| BHLHE40抗体 | Thermo Fisher | PA1-16546 | |
| 兔IgG | Thermo Fisher | -- | |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Sigma | SAB5700770-100UL |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Beyotime | A0208 | |
| DAB显色试剂盒 | Beyotime | P0202 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者组织收集 | 来自54名CRC患者的肿瘤和癌旁组织，排除术前接受化疗或放疗者；组织学由病理学家确认 阅读提示：Materials and methods，Patient tissues collection |
| 细胞培养和处理 | 细胞系：HCoEpiC、LoVo、HCT-15、Caco-2；培养基DMEM+10% FBS+1%青霉素/链霉素，37°C，5% CO2；iCRT3浓度75 μM，处理24小时 阅读提示：Materials and methods，Cell culture and treatment |
| 细胞增殖检测 | MTT实验：每孔5000细胞，孵育24、48、72小时，490nm测OD值 阅读提示：Materials and methods，Cell proliferation assay |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell：105细胞/室，侵袭实验需加Matrigel 50μL，迁移不加；24小时固定染色 阅读提示：Materials and methods，Cell migration and invasion assays |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI双染，5μL Annexin V-FITC和5μL PI，室温避光15-20分钟 阅读提示：Materials and methods，Flow cytometry |
| Western blot | 一抗稀释比和货号：BHLHE40 1:1000, Wnt 1:500, β-catenin 1:2000, cyclin D1 1:5000, c-myc 1:500, E-cadherin 1:500, N-cadherin 1:500, Vimentin 1:5000, β-actin 1:500；二抗1:1000 阅读提示：Materials and methods，Western blot |
| RT-qPCR | 组织RNA提取用miRNeasy FFPE Kit，细胞用Trizol；引物序列见原文 阅读提示：Materials and methods，RT-qPCR |
| 双荧光素酶实验 | pGL3-Basic载体，转染24小时；TOP/FOP flash质粒，Lipofectamine 2000转染 阅读提示：Materials and methods，Luciferase reporter assay |
| ChIP实验 | 细胞用1%甲醛交联10分钟，125mM甘氨酸终止；BHLHE40抗体1:50，兔IgG对照 阅读提示：Materials and methods，Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay |
| 体内实验 | BALB/C裸鼠，每组6只；皮下注射约107细胞，尾静脉约106细胞；肿瘤体积计算L×W2/2，4周或24天后取材 阅读提示：Materials and methods，In vivo experiments |
| HE染色 | 切片脱蜡、梯度乙醇水化，苏木素5分钟，伊红2分钟 阅读提示：Materials and methods，HE staining |
| 免疫组化 | 抗原修复用柠檬酸缓冲液，Ki67抗体1:100，BHLHE40抗体1:100，二抗1:1000 阅读提示：Materials and methods，Immunohistochemical analysis |