检测IARS2在宫颈癌中的表达
明确IARS2在宫颈癌细胞和组织中的表达水平。
通过qRT-PCR和Western blot检测Hela细胞中IARS2的mRNA和蛋白水平,并通过免疫组化检测宫颈癌组织与癌旁组织中的表达。
Mitochondrial protein isoleucyl-tRNA synthetase 2 in tumor cells as a potential therapeutic target for cervical cancer.
该研究包含体外细胞模型(Hela细胞)和患者组织样本,并通过基因沉默/过表达进行了功能验证(CCK-8、EdU、Transwell、凋亡检测),但缺乏动物模型和更深入的机制验证。
Hela细胞 正常宫颈上皮细胞(HCECs) 宫颈癌组织和癌旁组织
IARS2在宫颈癌细胞和组织中的表达水平 ShRNA沉默和过表达IARS2的转染效率 线粒体功能指标:JC-1染色、线粒体复合物I活性、ATP水平、ROS水平 细胞功能:CCK-8增殖、EdU掺入、Transwell迁移、TUNEL凋亡
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
明确IARS2在宫颈癌细胞和组织中的表达水平。
通过qRT-PCR和Western blot检测Hela细胞中IARS2的mRNA和蛋白水平,并通过免疫组化检测宫颈癌组织与癌旁组织中的表达。
为研究IARS2功能建立实验模型。
使用Lipofectamine 2000转染ShRNA(NC)和ShRNA(IARS2)以及pcMV-FLAG和pcMV-FLAG-IARS2质粒至Hela细胞。
探究IARS2沉默或过表达对线粒体功能的影响。
通过JC-1染色、DCFH-DA荧光染色、ELISA检测线粒体膜电位、ROS水平、复合物I活性和ATP水平。
检测IARS2对宫颈癌细胞行为的影响。
通过CCK-8、EdU染色和Transwell实验检测细胞活力、增殖和迁移。
探究IARS2沉默或过表达对细胞凋亡的影响。
通过Western blot检测凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2),并用TUNEL染色检测凋亡细胞。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | IARS2抗体 | Abcam | ab242116 |
| 二抗 | Abcam | ab288151 | |
| 细胞培养 | 人正常宫颈上皮细胞 | Procell | CP-H059 |
| HeLa细胞 | Procell | CL-0101 | |
| RPMI 1640培养基 | iCELL | iCell-0002 | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| pcMV-FLAG-IARS2质粒 | Sangon | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 两步RT-PCR试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| 7900 PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR GREEN PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 |
| IARS2抗体 | Abcam | ab242116 | |
| Cleaved caspase-3抗体 | Abcam | ab2302 | |
| Bax抗体 | Abcam | ab32503 | |
| Bcl-2抗体 | Abcam | ab182858 | |
| 二抗 | ZSGB-BIO | ZB-2305 | |
| 二抗 | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad | ChemiDoc | |
| CCK-8 | CCK-8试剂 | Solarbio | CA1210 |
| 细胞活力检测 | 台盼蓝 | Solarbio | C0040 |
| ELISA | 线粒体复合物I活性检测试剂盒 | Abcam | Ab109903 |
| ATP检测试剂盒 | Solarbio | BC0300 | |
| ROS检测试剂盒 | Solarbio | D6470 | |
| 酶标仪 | BioTek Instruments | Synergy | |
| 荧光染色 | JC-1染料 | Solarbio | M8650 |
| DCFH-DA | Solarbio | D6470 | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | -- | -- |
| 显微镜 | Olympus | CKX53 | |
| 荧光染色 | EdU | Beyotime | C0071S |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Zeiss | Axio |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系(Hela、HCECs)来源和培养基(RPMI 1640含10% FBS)及培养条件(37°C, 5% CO2) 阅读提示:Methods - Cell culture |
| 转染 | 转染试剂(Lipofectamine 2000)、质粒序列(shRNA和过表达质粒)及转染后换液次数 阅读提示:Methods - Short hairpin RNA (ShRNA) and plasmid transfection; Table 1 |
| qRT-PCR | RNA提取、逆转录试剂盒和PCR条件,以及引物序列 阅读提示:Methods - Real-time qRT-PCR; Table 2 |
| Western blot | 抗体稀释度、一抗孵育液、二抗稀释度及曝光系统 阅读提示:Methods - Western blot technique |
| 细胞功能检测 | CCK-8细胞密度和孵育时间、EdU浓度和固定时间、Transwell细胞密度和迁移时间 阅读提示:Methods - Cell counting kit-8 (CCK-8) viability and Trypan Blue cell death assays; Fluorescence staining; Transwell assay |
| 线粒体功能检测 | JC-1和DCFH-DA的激发/发射波长,ELISA试剂盒的使用步骤 阅读提示:Methods - Measurement of optical density (OD) values for JC-1 and Reactive Oxygen Species (ROS); Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) |
| 凋亡检测 | TUNEL染色的步骤和凋亡相关蛋白的检测条件 阅读提示:Methods - Fluorescence staining; Western blot technique; Figure 4 |