线粒体蛋白异亮氨酰-tRNA合成酶2在肿瘤细胞中作为宫颈癌潜在治疗靶点的研究

Mitochondrial protein isoleucyl-tRNA synthetase 2 in tumor cells as a potential therapeutic target for cervical cancer.

作者信息Xiaojiao Meng, Bo Gao, Ning Li
PMID38989294
发布时间2024-06-29
DOI10.25259/Cytojournal_17_2024

实验完整度

中

该研究包含体外细胞模型(Hela细胞)和患者组织样本,并通过基因沉默/过表达进行了功能验证(CCK-8、EdU、Transwell、凋亡检测),但缺乏动物模型和更深入的机制验证。

主要模型

Hela细胞 正常宫颈上皮细胞(HCECs) 宫颈癌组织和癌旁组织

重点核对

IARS2在宫颈癌细胞和组织中的表达水平 ShRNA沉默和过表达IARS2的转染效率 线粒体功能指标:JC-1染色、线粒体复合物I活性、ATP水平、ROS水平 细胞功能:CCK-8增殖、EdU掺入、Transwell迁移、TUNEL凋亡

摘要

目的:异亮氨酰-tRNA合成酶2(IARS2)对癌细胞中的线粒体活性和功能至关重要。宫颈癌是一种影响女性生殖系统的高度流行的恶性肿瘤。本研究探讨了IARS2在宫颈癌细胞中的表达和潜在作用。材料与方法:首先,我们通过Western blot和定量逆转录聚合酶链反应技术检测了宫颈癌细胞中IARS2的表达谱。随后,分别使用短发夹RNA(ShRNA)(IARS2)和pcMV-FLAG-IARS2构建了IARS2沉默和过表达的宫颈癌细胞模型。通过荧光染色、酶联免疫吸附试验、细胞计数试剂盒-8试验、Transwell实验、Western blot技术和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记试验技术,检测了IARS2沉默或过表达对Hela细胞线粒体膜电位、线粒体复合物I、三磷酸腺苷(ATP)水平、活性氧活性、活力、增殖、迁移、凋亡相关蛋白和凋亡水平的影响。结果:IARS2在宫颈癌细胞中表达上调。用ShRNA(IARS2)沉默IARS2会破坏宫颈癌细胞的线粒体功能,导致线粒体去极化、氧化应激增强、线粒体复合物I抑制和ATP水平降低。此外,IARS2的缺失显著阻碍了宫颈癌细胞的活力、增殖和迁移,诱导凋亡过程。相反,IARS2的过表达增强了宫颈癌细胞的增殖、迁移和ATP水平。结论:IARS2作为线粒体蛋白在促进宫颈癌细胞生长中发挥关键作用,是肿瘤诊断和治疗的一个创新靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
IARS2在宫颈癌细胞中的表达及其对线粒体功能和细胞增殖、迁移、凋亡的影响。
核心机制
IARS2通过维持线粒体功能(线粒体膜电位、复合物I活性、ATP生成、ROS稳态)来促进宫颈癌细胞的生长和存活。
主要证据
在Hela细胞中,IARS2沉默导致线粒体去极化、ROS升高、复合物I活性下降、ATP减少,并抑制增殖、迁移,诱导凋亡;过表达IARS2则增加ATP,促进增殖和迁移。
研究意义
IARS2是宫颈癌的诊断和治疗的新靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

检测IARS2在宫颈癌中的表达

明确IARS2在宫颈癌细胞和组织中的表达水平。

通过qRT-PCR和Western blot检测Hela细胞中IARS2的mRNA和蛋白水平,并通过免疫组化检测宫颈癌组织与癌旁组织中的表达。

2

建立IARS2沉默和过表达细胞模型

为研究IARS2功能建立实验模型。

使用Lipofectamine 2000转染ShRNA(NC)和ShRNA(IARS2)以及pcMV-FLAG和pcMV-FLAG-IARS2质粒至Hela细胞。

3

评估IARS2对线粒体功能的影响

探究IARS2沉默或过表达对线粒体功能的影响。

通过JC-1染色、DCFH-DA荧光染色、ELISA检测线粒体膜电位、ROS水平、复合物I活性和ATP水平。

4

评估IARS2对细胞活力、增殖和迁移的影响

检测IARS2对宫颈癌细胞行为的影响。

通过CCK-8、EdU染色和Transwell实验检测细胞活力、增殖和迁移。

5

评估IARS2对细胞凋亡的影响

探究IARS2沉默或过表达对细胞凋亡的影响。

通过Western blot检测凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2),并用TUNEL染色检测凋亡细胞。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
IARS2抗体Abcamab242116
二抗Abcamab288151
人正常宫颈上皮细胞ProcellCP-H059
HeLa细胞ProcellCL-0101
RPMI 1640培养基iCELLiCell-0002
胰蛋白酶----
胎牛血清----
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific--
pcMV-FLAG-IARS2质粒Sangon--
TRIzol试剂----
两步RT-PCR试剂盒Takara Bio--
7900 PCR系统Applied Biosystems--
SYBR GREEN PCR Master MixThermo Fisher Scientific--
GAPDH抗体Abcamab9485
IARS2抗体Abcamab242116
Cleaved caspase-3抗体Abcamab2302
Bax抗体Abcamab32503
Bcl-2抗体Abcamab182858
二抗ZSGB-BIOZB-2305
二抗ZSGB-BIOZB-2301
化学发光成像系统Bio-RadChemiDoc
CCK-8试剂SolarbioCA1210
台盼蓝SolarbioC0040
线粒体复合物I活性检测试剂盒AbcamAb109903
ATP检测试剂盒SolarbioBC0300
ROS检测试剂盒SolarbioD6470
酶标仪BioTek InstrumentsSynergy
JC-1染料SolarbioM8650
DCFH-DASolarbioD6470
Transwell小室----
显微镜OlympusCKX53
EdUBeyotimeC0071S
DAPIBeyotimeC1002
荧光显微镜ZeissAxio

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系(Hela、HCECs)来源和培养基(RPMI 1640含10% FBS)及培养条件(37°C, 5% CO2)
阅读提示:Methods - Cell culture
转染
转染试剂(Lipofectamine 2000)、质粒序列(shRNA和过表达质粒)及转染后换液次数
阅读提示:Methods - Short hairpin RNA (ShRNA) and plasmid transfection; Table 1
qRT-PCR
RNA提取、逆转录试剂盒和PCR条件,以及引物序列
阅读提示:Methods - Real-time qRT-PCR; Table 2
Western blot
抗体稀释度、一抗孵育液、二抗稀释度及曝光系统
阅读提示:Methods - Western blot technique
细胞功能检测
CCK-8细胞密度和孵育时间、EdU浓度和固定时间、Transwell细胞密度和迁移时间
阅读提示:Methods - Cell counting kit-8 (CCK-8) viability and Trypan Blue cell death assays; Fluorescence staining; Transwell assay
线粒体功能检测
JC-1和DCFH-DA的激发/发射波长,ELISA试剂盒的使用步骤
阅读提示:Methods - Measurement of optical density (OD) values for JC-1 and Reactive Oxygen Species (ROS); Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
凋亡检测
TUNEL染色的步骤和凋亡相关蛋白的检测条件
阅读提示:Methods - Fluorescence staining; Western blot technique; Figure 4