验证ZC3HAV1对cGAS-STING通路的影响
确定ZC3HAV1是否参与调控STING介导的信号通路。
使用野生型(WT)和Zc3hav1-/-小鼠腹腔巨噬细胞(PMs)，感染HSV-1或刺激ISD、cGAMP、DMXAA，检测STING、TBK1、IRF3、P65、IκBα的磷酸化水平及下游基因表达；siRNA敲低ZC3HAV1后重复检测；在Zc3hav1-/- MEFs中回补ZAPS或ZAPL，检测IRF3磷酸化。
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ZC3HAV1 促进 STING 激活并增强炎症
ZC3HAV1 facilitates STING activation and enhances inflammation.
实验完整度
高包含体外细胞实验（巨噬细胞、MEF、293T）、基因敲除/敲低、过表达回补及动物模型（Zc3hav1-/-小鼠）验证，并覆盖机制验证（相互作用、寡聚化、棕榈酰化、转位）和功能验证（细胞因子、病毒滴度）。
主要模型
小鼠腹腔巨噬细胞（PMs） Zc3hav1-/-小鼠 Zc3hav1-/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） HEK293T细胞
重点核对
PMs来自6-10周龄C57BL/6J小鼠，3%巯基乙酸盐肉汤腹腔注射3天后收获 刺激物浓度：ISD 5 μg/mL，cGAMP 3 μg/mL，DMXAA 150 μg/mL，LPS 200 ng/mL，poly(I:C) 20 μg/mL，R848 10 μg/mL，ODN1826 2 μM，H-151 1 μM siRNA敲低：siZc3hav1-1和siZc3hav1-2混合物转染PMs，INTERFERin试剂 HSV-1感染：2×10^7 PFU/只小鼠，腹腔注射，12小时或48小时 DMXAA模型：23 mg/kg腹腔注射，4小时后取样
摘要
干扰素基因刺激因子（STING）在胞质 DNA 感知过程中至关重要，对于启动先天免疫应答具有关键作用，在宿主防御中发挥重要功能，并参与炎症性疾病的发病机制。锌指 CCCH 型抗病毒蛋白 1（ZC3HAV1）特异性结合多种病毒 RNA 中的 CpG 二核苷酸并促进其降解。ZAPS（ZC3HAV1 短异构体）在抗病毒应答中是维甲酸诱导基因 I（RIG-I）信号传导的有效刺激因子。然而，ZC3HAV1 如何调控 STING 信号尚不清楚。在此，我们表明 ZC3HAV1 通过与 STING 结合、促进其寡聚化及从内质网（ER）向高尔基体的转位，从而特异性增强 STING 激活，促进 IRF3 和 NF-κB 通路的激活。相应地，Zc3hav1 缺陷以 STING 依赖性方式保护小鼠免受单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）感染或 5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）诱导的炎症。这些结果表明 ZC3HAV1 是 STING 信号传导的关键调节因子，提示其可能作为 STING 依赖性炎症的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ZC3HAV1 如何调控 STING 信号通路及其在 STING 依赖性炎症中的作用。
- 核心机制
- ZC3HAV1 通过与 STING 结合，促进其棕榈酰化、寡聚化以及从 ER 到高尔基体的转位，从而增强 STING 信号传导，激活 IRF3 和 NF-κB 通路。
- 主要证据
- Zc3hav1缺陷或敲低降低HSV-1、ISD、cGAMP或DMXAA刺激下的STING、TBK1、IRF3、P65、IκBα磷酸化，抑制Ifna4、ISGs及细胞因子表达；免疫共沉淀显示ZC3HAV1与STING相互作用；Native PAGE显示Zc3hav1缺陷减少STING二聚化/寡聚化；体内实验显示Zc3hav1缺陷减轻HSV-1感染和DMXAA诱导的炎症。
- 研究意义
- 揭示ZC3HAV1作为STING信号关键调控因子，可能作为STING依赖性炎症性疾病的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检查ZC3HAV1对TLR通路的影响
验证ZC3HAV1是否特异性作用于cGAS-STING通路而非TLR通路。
用LPS、poly(I:C)、ODN1826、Pam3CSK4、R848刺激WT和Zc3hav1-/- PMs，检测IRF3和IκBα磷酸化及细胞因子分泌；另外用VSV或poly(I:C)转染并敲低RIG-I检测Ifna4表达和IRF3磷酸化。
验证ZC3HAV1与STING的相互作用及其对STING寡聚化的影响
确定ZC3HAV1是否直接靶向STING并影响其寡聚化和TBK1招募。
免疫共沉淀检测内源及外源ZC3HAV1与STING结合；Native PAGE检测STING二聚化；检测TBK1与STING的结合；cGAMP结合实验。
研究ZC3HAV1对STING棕榈酰化、寡聚化和转位的影响
探究ZC3HAV1影响STING激活的机制（棕榈酰化、寡聚化、ER-高尔基转运）。
检测Zc3hav1缺陷对STING棕榈酰化（点击化学）、寡聚化（Native PAGE）和亚细胞定位（免疫荧光共聚焦）的影响。
体内验证Zc3hav1缺陷对STING依赖性炎症的影响
在动物水平验证ZC3HAV1在STING依赖性炎症中的作用。
WT和Zc3hav1-/-小鼠感染HSV-1或注射DMXAA，检测脾脏Ifna4表达、病毒滴度（空斑实验）、血清细胞因子和多个组织中的Il6 mRNA。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| 佛波醇酯 | -- | -- | |
| 药物处理 | 2'3'-cGAMP | InvivoGen | tlrl-nacga23-1 |
| 5,6-二甲基黄酮-4-乙酸 | InvivoGen | tlrl-dmx | |
| ODN 1826 | InvivoGen | tlrl-1826 | |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | |
| R848 | InvivoGen | tlrl-r848 | |
| 干扰素刺激DNA | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| 脂多糖 | Sigma Aldrich | L4130 | |
| 聚肌胞苷酸 | Sigma Aldrich | P1530 | |
| H-151 | MedChemExpress | HY-112693 | |
| 生物素标记cGAMP | BioLog Life Science Institute | C 157-001 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 |
| 蛋白G Plus琼脂糖 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | Pierce RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 89901 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| pull-down | Pierce链霉亲和素琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 20347 |
| ELISA | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Company Ltd. | 1217203 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Company Ltd. | 1210602 | |
| cGAMP ELISA试剂盒 | Cayman | 501700 | |
| RT-PCR | RNA fast 200 RNA提取试剂盒 | Fastagen | 220011 |
| HiScript III RT SuperMix用于qPCR（+gDNA去除剂） | Vazyme | R323-01 | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-03 | |
| Applied Biosystems StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA干扰 | INTERFERin转染试剂 | PolyPlus | 409-10 |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| 免疫荧光 | 免疫染色固定液 | Beyotime | P0098 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Solarbio | C0065 | |
| 蔡司激光共聚焦显微镜LSM980 | Zeiss | -- | |
| 点击化学 | 15-叠氮基十五烷酸 | NEW RESEARCH BIOSCIENCES | Y-AJS-24014 |
| 硫酸铜 | MACKUN | C805782 | |
| TBTA配体 | MACKUN | T823729 | |
| 生物素-炔烃 | Aladdin | B171422 | |
| 三(2-羧乙基)膦 | MACKUN | T819166 | |
| 空斑实验 | 甲基纤维素 | -- | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 抗体 | 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig |
| 辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗兔IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| 抗小鼠IgG抗体 | ABclonal | AC011 | |
| 抗兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| 抗磷酸化IκBα (Ser32, 14D4) 抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 抗磷酸化P65 (Ser536, 93H1) 抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗P65 (D14E12) 抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗STING (D1V5L) 抗体 | Cell Signaling Technology | 50494 | |
| 抗磷酸化IRF3 (Ser396, 4D4G) 抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| 抗IRF3 (D83B9) 抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗磷酸化TBK1 (Ser172, D52C2) 抗体 | Cell Signaling Technology | 5483S | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3013 | |
| 抗ZC3HAV1抗体 | Proteintech | 16820-1-AP | |
| 抗STING (19851-1-AP) 抗体 | Proteintech | 19851-1-AP | |
| 抗HA (HA-7) 抗体 | Sigma Aldrich | H3663 | |
| 抗Myc (9E10) 抗体 | Sigma Aldrich | M4439 | |
| 抗Flag (M2) 抗体 | Sigma Aldrich | F1804 | |
| 抗HA (CB051) 抗体 | Origene | TA180128-1 | |
| 抗Myc (9E10, TA1501211) 抗体 | Origene | TA1501211 | |
| 抗GM130抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-55591 | |
| 抗Calnexin抗体 | Abcam | ab22595 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21071 | |
| 兔抗小鼠IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11059 | |
| 质粒构建 | ZAPS表达质粒 | WZ Bioscience, Inc. | CH892071 |
| ZAPL表达质粒 | Changsha Youze Biotechnology Co., Ltd. | YZ-B021001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 小鼠PMs制备：6-10周龄C57BL/6J小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐肉汤，3天后收获；MEFs来自13-14天胚胎；细胞培养条件：DMEM+10%胎牛血清，37°C、5% CO2 阅读提示：见Materials and methods: Mice, Cell culture |
| 刺激物处理 | 刺激物浓度：ISD 5 μg/mL；cGAMP 3 μg/mL；DMXAA 150 μg/mL；LPS 200 ng/mL；Pam3CSK4 1 μg/mL；poly(I:C) 20 μg/mL；R848 10 μg/mL；ODN 1826 2 μM；H-151 1 μM 阅读提示：见Materials and methods: Reagents and antibodies |
| RNA干扰 | siRNA序列：siZc3hav1-1和siZc3hav1-2混合物（浓度未明确）；siRig-i混合物；对照siRNA序列；INTERFERin试剂转染 阅读提示：见Materials and methods: RNA interference assay |
| 蛋白检测 | 免疫印迹：RIPA裂解，SDS-PAGE，PVDF膜；免疫沉淀：IP缓冲液，蛋白G琼脂糖；Native PAGE：7%非变性凝胶，电泳条件45 mA预跑30分钟，25 mA 6小时 阅读提示：见Materials and methods: Immunoblot and IP analysis, Native PAGE analysis |
| 动物实验 | HSV-1感染：6-8周龄WT和Zc3hav1-/-小鼠，2×10^7 PFU腹腔注射，12小时或48小时；DMXAA模型：16-18g雄性小鼠，23 mg/kg腹腔注射，4小时；H-151处理：750 nM/只，1小时前 阅读提示：见Materials and methods: Viral infection in vivo, In vivo DMXAA model |