RHOF表达分析
检测RHOF在胰腺癌组织和细胞中的表达水平及其与预后的关联。
利用TCGA数据库分析RHOF表达及生存期，qRT-PCR、western blotting和IHC检测PC组织和细胞系中RHOF表达。
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RHOF通过增强PKM2介导的糖酵解促进Snail1乳酸化，诱导胰腺癌细胞内皮-间质转化
RHOF promotes Snail1 lactylation by enhancing PKM2-mediated glycolysis to induce pancreatic cancer cell endothelial-mesenchymal transition.
实验完整度
高包含细胞功能实验（增殖、凋亡、迁移、侵袭）、代谢检测（ECAR/OCR、葡萄糖摄取、乳酸产生）、分子机制验证（ChIP、荧光素酶、免疫共沉淀）及体内异种移植模型，证据层级独立且完整。
主要模型
PANC-1细胞 SW1990细胞 HPAF-II细胞 BALB/c裸鼠异种移植模型
重点核对
RHOF敲低和过表达的效率验证 c-Myc与PKM2启动子结合验证（ChIP和荧光素酶） 2-DG抑制糖酵解对Snail1乳酸化的影响 Snail1沉默对RHOF和乳酸促进EMT的逆转 体内shRHOF对肿瘤生长和EMT的影响（n=5）
摘要
背景：探讨小Rho GTP酶Rif（RHOF）对肿瘤生长、糖酵解和内皮-间质转化（EMT）的影响，以及RHOF在胰腺癌（PC）中的潜在机制。方法：通过qRT-PCR和western blotting检测PC组织和细胞中RHOF的表达。使用CCK-8、集落形成、EdU、流式细胞术、划痕和Transwell实验评估PC细胞的活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭。使用western blotting检测EMT和糖酵解相关蛋白的表达。使用生物信息学分析确定RHOF在PC中的潜在作用机制。使用异种移植小鼠模型在体内评估RHOF的作用。结果：RHOF过表达加速PC细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制凋亡。RHOF过表达促进EMT和糖酵解，表现为E-钙黏蛋白表达降低，N-钙黏蛋白、波形蛋白、HK2、PKM2和LDHA表达增加。生物信息学分析表明，RHOF激活EMT、糖酵解和Myc靶点，且c-Myc可与PKM2启动子结合。RHOF过表达促进Snail1的乳酸化和核转位。沉默Snail1逆转了RHOF和乳酸对细胞迁移、侵袭和EMT的促进作用。此外，体内肿瘤生长和EMT被RHOF沉默抑制。结论：RHOF在PC中发挥致癌作用。RHOF上调c-Myc，促进PKM2转录。PKM2进一步诱导糖酵解，糖酵解产生的乳酸导致Snail1乳酸化，最终促进EMT。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RHOF在胰腺癌中如何调控糖酵解和内皮-间质转化（EMT），其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- RHOF通过上调c-Myc促进PKM2转录，增强糖酵解，产生乳酸，乳酸诱导Snail1乳酸化并促进其核转位，最终促进EMT。
- 主要证据
- 体外实验显示RHOF过表达促进细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，并增加糖酵解；机制上，ChIP和荧光素酶实验证实c-Myc直接结合PKM2启动子；IP和免疫荧光显示RHOF促进Snail1乳酸化；体内异种移植实验证实shRHOF抑制肿瘤生长和EMT。
- 研究意义
- 本研究揭示了RHOF在胰腺癌发生中的新分子机制，为胰腺癌治疗提供了新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RHOF对细胞增殖和凋亡的影响
评估RHOF对胰腺癌细胞活力、增殖和凋亡的功能影响。
在PANC-1和SW1990细胞中敲低RHOF，在HPAF-II细胞中过表达RHOF，用CCK-8、EdU、集落形成和流式细胞术检测。
RHOF对细胞迁移、侵袭和EMT的影响
评估RHOF对胰腺癌细胞迁移、侵袭和EMT标志物表达的影响。
划痕实验和Transwell实验检测迁移和侵袭；qRT-PCR和western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达。
RHOF对糖酵解的影响
评估RHOF对胰腺癌细胞糖酵解水平和相关酶表达的影响。
检测ECAR、OCR、葡萄糖摄取、乳酸产生，并通过western blot检测HK2、PKM2、LDHA表达。
机制验证：c-Myc和PKM2
验证RHOF是否通过c-Myc调控PKM2转录。
GSEA分析RHOF激活通路，western blot检测c-Myc表达，MOTIF预测结合位点，荧光素酶报告基因和ChIP验证结合。
挽救实验验证PKM2介导RHOF对糖酵解的作用
验证PKM2是否介导RHOF对糖酵解的影响。
在PANC-1细胞中敲低RHOF并过表达PKM2，在HPAF-II细胞中过表达RHOF并敲低PKM2，检测ECAR、OCR、葡萄糖摄取和乳酸产生。
RHOF通过糖酵解和Snail1乳酸化促进EMT
验证RHOF是否通过糖酵解产生的乳酸诱导Snail1乳酸化，从而促进EMT。
用IP检测Snail1乳酸化，免疫荧光检测Kla和Snail1共定位，加入2-DG抑制糖酵解后检测乳酸化和EMT，沉默Snail1后检测迁移和EMT。
体内异种移植模型验证RHOF功能
在体内验证RHOF沉默对肿瘤生长和EMT的影响。
将转染shRHOF或shNC的PANC-1细胞接种于BALB/c裸鼠，测量肿瘤体积和重量，进行TUNEL、IHC和western blot分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | ProCell | -- |
| 最低必需培养基 | -- | -- | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | ProCell | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green PCR试剂盒 | Qiagen | -- |
| LightCycler 480 II | Roche | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗RHOF抗体 | Abcam | ab101349 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗E-cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| 抗N-cadherin抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 抗Vimentin抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| 抗HK2抗体 | Abcam | ab227198 | |
| 抗PKM2抗体 | Abcam | ab137791 | |
| 抗LDHA抗体 | Abcam | ab52488 | |
| 抗Snail1抗体 | Proteintech | 13099-1-AP | |
| 抗c-Myc抗体 | Proteintech | 10828-1-AP | |
| 二抗 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| ECL发光液 | Nanjing KeyGEN Biotech Co., Ltd. | -- | |
| CCK-8实验 | CCK-8溶液 | Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd. | -- |
| 分光光度计 | BioTek Instruments | -- | |
| 集落形成实验 | 甲醇 | Sigma-Aldrich | -- |
| 结晶紫 | Sigma-Aldrich | -- | |
| EdU实验 | EdU | RiboBio | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 流式细胞术 | FITC标记的Annexin V | -- | -- |
| 碘化丙啶 | Dojindo | -- | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Transwell实验 | Transwell系统 | Corning | -- |
| Matrigel | -- | -- | |
| 代谢分析 | XF96细胞外通量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | -- | -- | |
| 代谢检测 | 乳酸检测试剂盒II | Sigma-Aldrich | MAK065 |
| 葡萄糖摄取比色检测试剂盒 | Biovision | K676-100 | |
| 荧光素酶实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| ChIP实验 | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | CST | -- |
| 免疫荧光 | 抗Kla抗体 | PTM Biolabs | PTM-1401RM |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150113 | |
| 山羊抗兔 (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150078 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab9498 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150119 | |
| 山羊抗兔 (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗Snail1抗体 | Abcam | ab216347 |
| 抗pan-Kla抗体 | PTM Biolabs | PTM-1401 | |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | GemPharmatech Co., Ltd. | -- |
| IHC | 柠檬酸钠抗原修复液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗RHOF抗体 | Sigma-Aldrich | HPA076019 | |
| 抗Ki67抗体 | CST | 34330 | |
| DAB显色液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 显微镜 | Nikon Eclipse | -- | |
| TUNEL染色 | 原位细胞死亡检测试剂盒 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基类型、血清浓度、抗生素浓度、培养温度、CO2浓度 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 转染 | siRNA序列、质粒载体、转染试剂、转染时间 阅读提示：Methods: Cell transfection |
| qRT-PCR | 引物序列、内参基因、PCR条件、数据分析方法 阅读提示：Methods: qRT-PCR |
| Western blot | 抗体稀释度、孵育条件、蛋白上样量 阅读提示：Methods: Western blot |
| 增殖和凋亡检测 | 细胞密度、孵育时间、CCK-8时间、EdU浓度、流式染色步骤 阅读提示：Methods: CCK-8 assay, colony formation, EdU assay, flow cytometry |
| 迁移和侵袭检测 | 细胞密度、划痕工具、观测时间、Transwell基质胶有无、培养时间 阅读提示：Methods: scratch assay, Transwell assay |
| 代谢检测 | 细胞密度、OCR/ECAR检测试剂浓度、葡萄糖和乳酸检测步骤 阅读提示：Methods: measurement of oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, measurement of lactate production and glucose uptake |
| 机制验证 | 荧光素酶报告基因质粒、ChIP抗体、免疫沉淀抗体 阅读提示：Methods: luciferase assay, chromatin immunoprecipitation assay, immunoprecipitation |
| 体内实验 | 细胞数、动物品系、每组数量、接种部位、测量时间 阅读提示：Methods: Xenograft mice models |