关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肌球蛋白1b在胶质母细胞瘤中的异常过表达通过VEGF-myc-myosin 1b-Piezo1轴促进血管生成
Aberrant overexpression of myosin 1b in glioblastoma promotes angiogenesis via VEGF-myc-myosin 1b-Piezo1 axis.
实验完整度
高包含体外细胞实验、患者样本和动物模型等证据层级，并明确功能验证和机制验证（如敲低/过表达、类器官、免疫染色、钙成像）。
主要模型
人脐静脉内皮细胞系HUVEC 小鼠脑内皮细胞系bEnd.3 HEK293T细胞 RCAS诱导的小鼠GBM模型
重点核对
VEGFA处理浓度25 ng/ml，处理时间HUVEC 48h，bEnd.3 24h Yoda1浓度HUVEC 2μM，bEnd.3 4μM；Dooku1浓度4μM和2μM 细胞系来源：HUVEC和bEnd.3由陕西师范大学提供；HEK293T由第四军医大学提供 小鼠模型：雌性C57BL6 Gtva; Arf-/-小鼠，RCAS-PDGFB-HA细胞立体定向注射105细胞 患者样本：西京医院手术切除GBM肿瘤及邻近正常组织
摘要
胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的颅内恶性肿瘤，预后差。血管生成增强是GBM的重要标志，表现为广泛的微血管增殖和异常血管。在此，我们揭示了肌球蛋白1b在GBM血管生成和血管异常中的关键作用。与配对的非恶性脑组织相比，GBM内皮细胞（ECs）中肌球蛋白1b上调。在我们的研究中，我们发现肌球蛋白1b促进人/小鼠脑内皮细胞的迁移、增殖和血管生成。我们还发现，ECs中肌球蛋白1b的表达可通过myc受血管内皮生长因子（VEGF）信号调控。此外，肌球蛋白1b通过Piezo1增强Ca2+内流促进血管生成，其中VEGF可以是触发因素。总之，我们的结果确定肌球蛋白1b是通过机械敏感离子通道组分1（Piezo1）促进血管生成的关键介质，并提示VEGF/myc信号通路可能驱动GBM ECs中肌球蛋白1b过表达的变化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肌球蛋白1b在GBM内皮细胞中的异常高表达是否影响血管生成及血管完整性，并通过何种机制发挥作用。
- 核心机制
- VEGF信号通过转录因子myc上调内皮细胞中肌球蛋白1b表达，肌球蛋白1b通过Piezo1诱导细胞内钙内流，从而促进血管生成。
- 主要证据
- 在HUVEC和bEnd.3细胞中通过过表达/敲低肌球蛋白1b验证其促进增殖、迁移和血管生成；VEGFA刺激上调myc和肌球蛋白1b，敲低myc可消除VEGFA效应；荧光素酶报告和ChIP实验证明myc直接结合肌球蛋白1b启动子；3D发芽实验表明Piezo1激动剂/拮抗剂和钙缺乏影响肌球蛋白1b促血管生成作用；临床及小鼠样本中肌球蛋白1b和Piezo1表达上调。
- 研究意义
- 本研究首次探索肌球蛋白1b与GBM血管的关系，为GBM的治疗干预提供了潜在的靶点。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基 | ScienCell | 1001 |
| 胎牛血清 | ScienCell | 0025 | |
| 内皮细胞生长补充剂 | ScienCell | 1052 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | ScienCell | 0503 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11995073 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10099141C | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| 动物模型制备 | OCT包埋剂 | Sakura Tissue-Tek | 4583 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | Apexbio | k1018 |
| 酶标仪 | Hitachi | SH-9000 | |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| 增强化学发光系统 | Tanon Science and Technology | Tanon | |
| 抗VE-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab205336 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3195T | |
| 抗MMP1抗体 | Abcam | ab134184 | |
| 抗MMP9抗体 | Abcam | ab76003 | |
| 抗MMP14抗体 | Abcam | ab51074 | |
| 抗ANXA1抗体 | Cell Signaling Technology | 32934T | |
| 抗ANXA3抗体 | Abcam | ab127924 | |
| 抗ANXA5抗体 | Cell Signaling Technology | 8555S | |
| 抗ANXA6抗体 | Cell Signaling Technology | 29015S | |
| 抗ANXA10抗体 | Abcam | ab213656 | |
| 抗连接蛋白43抗体 | Cell Signaling Technology | 83469T | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174S | |
| 抗肌球蛋白1b抗体 | Abcam | EPR16223 | |
| 抗myc抗体 | Cell Signaling Technology | 9402S | |
| 抗Piezo1抗体 | Proteintech | 15939-1-AP | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 8457S | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T3526 | |
| HRP标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| RT-qPCR | RNAiso Plus试剂 | Takara Bio | 9109 |
| 一步法SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒 | Takara Bio | RR820A | |
| 热循环仪 | Bio-Rad | C1000 | |
| 免疫染色 | DAPI染色液 | Abcam | ab228549 |
| 冷冻切片机 | Leica | -- | |
| 显微镜 | Zeiss | Axio | |
| 抗CD31抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | |
| 山羊抗叙利亚仓鼠Alexa 568二抗 | Abcam | ab175716 | |
| 山羊抗叙利亚仓鼠Alexa 488二抗 | Abcam | ab173003 | |
| 山羊抗兔Alexa 594二抗 | Abcam | ab150080 | |
| 驴抗兔Alexa 488二抗 | Abcam | ab150073 | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | BD bioscience | 3422 |
| ECM胶 | R&D Systems | 3536-005-02 | |
| 荧光微球 | Sigma Aldrich | 234,340 | |
| 钙检测 | 细胞内钙含量检测试剂盒 | Beyotime | s1603s |
| Yoda1 | Sigma-Aldrich | SML1558-5 | |
| Dooku1 | Sigma-Aldrich | SML2397 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 药物处理 | 血管内皮生长因子A | MCE | HY-P7110 |
| 血管内皮生长因子A | MCE | HY-P70638 | |
| 3D培养 | AggreWell400微孔培养板 | STEMCELL | 34,425 |
| 大鼠尾I型胶原 | Corning | 354,236 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | TCS | |
| 无钙DMEM | Gibco | 21,068 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11960 | |
| 荧光素酶报告 | 荧光素酶检测试剂盒 | Guangzhou Fulengen | LF031 |
| Fura-2测量 | Hank's平衡盐溶液 | Pricella | PB180123 |
| Fura 2/AM | -- | -- | |
| 荧光酶标仪 | Tecan | Spark | |
| H&E染色 | H&E染色试剂盒 | Beyotime | C0105S |
| 切片扫描仪 | Olympus | Slideview | |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| 兔抗myc抗体 | Cell Signaling Technology | 9402S | |
| 小鼠IgG | Millipore | 12-371B | |
| 管形成 | 血管生成检测试剂盒 | Abcam | AB204726 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源：HUVEC和bEnd.3由陕西师范大学提供，HEK293T由第四军医大学提供；培养基及添加物：内皮细胞培养基（ScienCell 1001）含5%FBS、1%内皮生长补充剂、1%青霉素/链霉素；HEK293T用DMEM（Gibco 11995073）含10%FBS和1%抗生素-抗真菌溶液。 阅读提示：参见Experimental procedures中的Cell lines and cell culture |
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL6 Gtva; Arf-/-；性别：雌性；年龄：6-8周；注射细胞：RCAS-PDGFB-HA（DF-1细胞）105个；对照组注射PBS；观察终点：症状出现或15周；麻醉：氯胺酮75 mg/kg和甲苯噻嗪10 mg/kg。 阅读提示：参见Experimental procedures中的Animals, patient tissue samples, and the preparation |
| 药物处理 | VEGFA浓度25 ng/ml，处理时间HUVEC 48h，bEnd.3 24h；Yoda1浓度2μM（HUVEC）和4μM（bEnd.3）；Dooku1浓度4μM（HUVEC）和2μM（bEnd.3）；处理时间24h。 阅读提示：参见Figure 3、Figure 5及Intracellular calcium content detection部分 |
| 细胞功能实验 | 伤口愈合实验：2×10^5细胞/孔接种6孔板，划痕后培养时间：敲低组24h，过表达组12h；Transwell迁移实验：4×10^4细胞，培养36h；CCK-8：1000细胞/孔，加10μl CCK-8，孵育3h，测490nm。 阅读提示：参见Wound-healing assay、Transwell migration assay和Cell proliferation assay部分 |
| 血管生成实验 | 3D发芽实验：1×10^5细胞形成球体，培养2周；胶原浓度3 mg/ml；处理VEGFA 25 ng/ml，Yoda1/Dooku1浓度如前；培养24h。无钙实验使用无钙DMEM（21068）和常规DMEM（11960），无FBS，培养16h。管形成实验：96孔板，ECM胶，细胞培养18h。 阅读提示：参见In vitro 3D spheroid cultivation and sprouting angiogenesis assay和Tube formation assay部分 |
| 钙检测 | 细胞内钙检测：细胞密度60%时加药处理24h；Fura 2/AM测量：2.5μM Fura 2/AM负载45min，激发340/380nm，发射492nm，每18秒记录。 阅读提示：参见Intracellular calcium content detection和Fura 2/AM Ca2+ real time measurement部分 |
| 转录调控验证 | 荧光素酶报告：HEK293T细胞共转染myc和pGL3.0-pMyosin1b-Luc，48h后检测；ChIP：甲醛交联10min，微球菌核酸酶消化20min，抗体：anti-myc（9402S）和IgG阴性对照。 阅读提示：参见Luciferase reporter assay和ChIP assay部分 |