circSEC24B的鉴定与表达分析
验证circSEC24B的存在、环状结构及其在CRC中的表达水平。
通过对RAPA处理的HCT116/OXA细胞进行circRNA测序，筛选差异表达circRNA；使用PCR和Sanger测序验证circSEC24B的backsplice位点；通过RNase R处理、RT-qPCR和FISH检测circSEC24B的环状结构和表达。
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circSEC24B通过OTUB1介导的SRPX2去泛素化激活自噬并诱导结直肠癌化疗耐药
CircSEC24B activates autophagy and induces chemoresistance of colorectal cancer via OTUB1-mediated deubiquitination of SRPX2.
实验完整度
高研究包含体外细胞模型、体内裸鼠移植瘤模型、临床组织样本，并进行了功能获得/丧失、机制验证（RNA pulldown、RIP、Co-IP、泛素化检测）等多层级验证。
主要模型
人结直肠癌细胞系HCT116、LoVo及其奥沙利铂耐药株 人正常结肠黏膜上皮细胞NCM460 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型 结直肠癌患者组织样本
重点核对
奥沙利铂耐药细胞系的构建及耐药浓度 circSEC24B表达水平与临床组织样本的关联 自噬抑制剂3-MA和自噬底物LC3-II、SQSTM1的水平 OTUB1与SRPX2结合的蛋白质结构域O-3 SRPX2蛋白的泛素化水平及半衰期
摘要
环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合单链环状结构的调节性RNA。有证据表明，circRNA在多种癌症的发生和发展中发挥重要作用。然而，circRNA对自噬介导的结直肠癌（CRC）进展的影响仍不清楚。本项目旨在研究circSEC24B对CRC自噬的影响及其潜在机制。采用PCR和Sanger测序技术验证circSEC24B在CRC细胞和组织中的存在和环状结构。使用CCK8、transwell和Edu实验评估CRC细胞的耐药和侵袭表型。通过功能获得和丧失实验评估circSEC24B及其蛋白伙伴对CRC细胞体外和体内生长、侵袭和转移的影响。通过免疫荧光、RNA pulldown和RIP实验分析circSEC24B、OTUB1和SRPX2之间的相互作用。使用质谱分析鉴定CRC细胞中circRNA的潜在结合蛋白。构建载体以研究去泛素化酶OTUB1与circSEC24B结合的特异性结构域。结果显示，circSEC24B在CRC组织和细胞系中表达升高，并增强CRC细胞增殖和自噬水平。机制上，circSEC24B通过调节SRPX2的蛋白稳定性促进CRC细胞增殖。具体而言，circSEC24B作为支架，促进OTUB1与SRPX2的结合，从而增强其蛋白稳定性。此外，有证据表明OTUB1通过乙酰化依赖性机制调节SRPX2的表达。总之，本研究表明circSEC24B通过促进去泛素化酶OTUB1介导的SRPX2去泛素化，激活自噬并诱导CRC化疗耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circSEC24B是否通过调控自噬影响结直肠癌的化疗耐药及其潜在机制。
- 核心机制
- circSEC24B作为支架促进OTUB1与SRPX2结合，OTUB1以乙酰化依赖性方式去泛素化SRPX2，增强其蛋白稳定性，从而激活自噬并诱导化疗耐药。
- 主要证据
- 在CRC细胞系和组织中检测到circSEC24B高表达；RNA pulldown和RIP实验证实circSEC24B与SRPX2及OTUB1相互作用；western blot显示circSEC24B敲低缩短SRPX2半衰期并增加其泛素化；体内移植瘤实验证实敲低circSEC24B抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 该研究为CRC化疗耐药提供了新的见解，并可能有助于识别自噬相关的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circSEC24B对CRC细胞增殖和耐药的功能影响
评估circSEC24B对CRC细胞增殖能力和奥沙利铂耐药的影响。
通过circSEC24B过表达质粒和shRNA转染CRC细胞，利用CCK-8、集落形成和EdU实验检测细胞增殖，并在奥沙利铂存在下评估耐药性；通过体内裸鼠移植瘤实验验证circSEC24B对肿瘤生长的影响。
circSEC24B对自噬水平的影响
验证circSEC24B是否调节CRC细胞的自噬水平。
通过western blot检测自噬标记物LC3-II、SQSTM1、ATG5和Beclin1的表达；使用mCherry-GFP-LC3报告基因和透射电镜检测自噬流和自噬体数量；使用自噬抑制剂3-MA和Baf-1处理细胞，评估circSEC24B对自噬的影响。
circSEC24B调控SRPX2蛋白稳定性的机制探索
探究circSEC24B调控SRPX2表达的具体机制。
通过RT-qPCR和western blot检测circSEC24B对SRPX2 mRNA和蛋白水平的影响；CHX实验检测SRPX2半衰期；MG132处理评估泛素-蛋白酶体途径；泛素化实验检测SRPX2的泛素化水平。
鉴定circSEC24B相互作用蛋白OTUB1及其功能
寻找介导SRPX2去泛素化的去泛素化酶。
通过biotin标记的RNA pulldown结合质谱筛选circSEC24B结合蛋白，从中鉴定出去泛素化酶OTUB1；Co-IP验证OTUB1与SRPX2的相互作用；截短体实验确定OTUB1与SRPX2结合的结构域；分析OTUB1对SRPX2蛋白稳定性和泛素化的影响。
circSEC24B作为支架增强OTUB1与SRPX2的相互作用
验证circSEC24B是否促进OTUB1与SRPX2的结合。
通过Co-IP检测circSEC24B过表达或敲低对OTUB1-SRPX2相互作用的影响；使用RNase A和RNase R处理细胞以验证circSEC24B的支架作用；分析OTUB1对SRPX2的泛素化在circSEC24B敲低下的变化。
OTUB1调控SRPX2的乙酰化依赖性机制
探究OTUB1是否通过乙酰化修饰调节SRPX2的功能。
使用NAM和EX-527处理CRC细胞，检测SRPX2蛋白表达和乙酰化水平的变化；过表达SIRT1及其去乙酰化酶缺陷突变体，检测SRPX2乙酰化水平和蛋白表达；Co-IP检测NAM处理对OTUB1-SRPX2结合的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 奥沙利铂 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 逆转录试剂盒 | Promega | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| AB 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗PSMD7一抗 | Proteintech | 68188-1-Ig | |
| 抗EIF3F一抗 | Abclonal | A7023 | |
| 抗GAPDH一抗 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗LC3 II一抗 | Abcam | ab192890 | |
| 抗SQSTM1一抗 | Abcam | ab109012 | |
| 抗DLG4一抗 | Proteintech | 20665-1-AP | |
| 抗SGK1一抗 | Proteintech | 28454-1-AP | |
| 抗IDO1一抗 | Proteintech | 13268-1-AP | |
| 抗SRPX2一抗 | Proteintech | 66266-1-Ig | |
| 抗FCAN一抗 | Proteintech | 10205-2-AP | |
| 抗E-cadherin一抗 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| 抗N-cadherin一抗 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 抗p-FAK一抗 | Abcam | ab81298 | |
| 抗FAK一抗 | Proteintech | 66258-1-Ig | |
| 抗p-SRC一抗 | Abcam | ab40660 | |
| 抗SRC一抗 | Proteintech | 11097-1-AP | |
| 抗OTUB1一抗 | ThermoFisher | PA5-118134 | |
| 抗SIRT1一抗 | Cell Signaling | #8469 | |
| 兔多克隆抗乙酰化赖氨酸抗体 | Cell Signaling | #9441 | |
| CCK-8 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| EdU | EdU试剂盒 | Ribobio | -- |
| Hoechst 33342染料 | -- | -- | |
| 细胞转染 | mRFP-GFP-LC3腺病毒 | Hanbio Co. Ltd. | -- |
| RNA-FISH | 荧光原位杂交试剂盒 | RiboBio | -- |
| RNA pull-down | 磁珠RNA-蛋白pull-down试剂盒 | Thermo | -- |
| RIP | RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Geneseed | -- |
| Co-IP | FLAG抗体 | Abcam | ab205606 |
| ChIP | ZFX抗体 | ThermoFisher | PA5-78234 |
| IHC | Ki-67抗体 | Proteintech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与耐药株构建 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、OXA起始浓度、递增方案及稳定耐药株的验证方法 阅读提示：材料与方法中的“Cell culture”部分 |
| 药物处理 | OXA处理浓度（HCT116 25μM，LoVo 20μM）、处理时间、RAPA浓度及作用时间、3-MA浓度及作用时间、Baf-1浓度及作用时间、CHX浓度及时间点、MG132浓度及时间 阅读提示：材料与方法中的“Cell culture”和“Drug treatment”相关部分，以及Results中的实验描述 |
| 转染与感染 | 质粒和shRNA的序列、载体信息、转染试剂浓度、转染时间（48小时）、感染效率评估方法 阅读提示：材料与方法中的“Cell transfection”部分 |
| 自噬检测 | 自噬标记物LC3-II、SQSTM1、ATG5、Beclin1的检测方法；mCherry-GFP-LC3报告基因的使用；3-MA、Baf-1处理条件；TEM观察及自噬体计数方法 阅读提示：材料与方法中的“Western blot”和“Autophagy detection”相关部分，以及Results中的“CircSEC24B elevated the autophagy level of CRC cells” |
| 蛋白稳定性与泛素化检测 | CHX实验的时间点、MG132浓度及处理时间、泛素化实验的条件（包括所用抗体和试剂） 阅读提示：材料与方法中的“Western blot”和“Ubiquitination assay”相关部分，以及Results中的“CircSEC24B increased CRC proliferative ability by regulating the protein stability of SRPX2” |
| 体内实验 | 裸鼠品系、性别、周龄、细胞接种量（1×10^6）和体积、分组数量、各组的处理（OXA给药方案）、肿瘤测量及计算方式、处死时间 阅读提示：材料与方法中的“Animal experimentation”部分 |