高脂饮食诱导肝脏炎症模型建立与表型分析
建立大黄鱼脂质过剩诱导的肝脏炎症模型，评估脂质积累、肝损伤和炎症表型。
对大黄鱼幼鱼进行10周高脂饮食（HFD，18%粗脂质）或对照饮食（CON，12%粗脂质）饲喂，分析体重、肝TG、血浆游离脂肪酸、ALT/AST、肝脏H&E染色、炎症因子表达、p65核定位及乙酰化水平。
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肝脏线粒体脂肪酸β-氧化来源的乙酰辅酶A通过增强p65乙酰化加重炎症
Acetyl-CoA derived from hepatic mitochondrial fatty acid β-oxidation aggravates inflammation by enhancing p65 acetylation.
实验完整度
高包含体内高脂饮食模型、体外鱼原代肝细胞与AML12细胞模型，结合乙酰化组学、LC-MS、Western blot、EMSA及双荧光素酶等，明确功能与机制验证。
主要模型
大黄鱼幼鱼（高脂饮食诱导肝脏炎症模型） 大黄鱼原代肝细胞 AML12小鼠肝细胞 HEK293T细胞
重点核对
高脂饮食（HFD）含18%粗脂质，对照饮食含12%粗脂质，饲喂10周 棕榈酸（PA）浓度：鱼肝细胞使用100 μM处理12小时；AML12细胞使用500 μM处理24小时 抑制剂使用：etomoxir（CPT1α抑制）、SB-204990（ACLY抑制）、MK-2206（Akt抑制）、c646（CBP抑制）、MB-3（GCN5抑制）、resveratrol（SIRT1激活）、AICAR（AMPK激活） 关键位点：p65 Lys63和Lys147突变增强其转录活性和DNA结合能力；ACLY Ser455磷酸化、Akt Ser473磷酸化、AMPK Thr172磷酸化 检测指标：肝TG、血浆游离脂肪酸、ALT/AST、KAT活性、NAD+/NADH比值、乙酰辅酶A含量、p65乙酰化、组蛋白H3乙酰化
摘要
乙酰化协调许多生物过程以确保细胞对营养物质的适当反应。然而，乙酰化如何调控脂质过剩诱导的炎症仍知之甚少。在这里，我们发现高脂饮食（HFD）增强了线粒体脂肪酸β-氧化，从而提高了大黄鱼肝脏中的乙酰辅酶A水平。HFD激活了ACLY，以调控“柠檬酸转运”将乙酰辅酶A从线粒体转移到细胞核。升高的乙酰辅酶A激活了CBP以增加p65乙酰化，随后加重了炎症。随着NAD+/NADH的下降，SIRT1失活，进一步加重了炎症。因此，乙酰化依赖性转录因子活性调控是营养应激下对促炎刺激的适应，这在AML12肝细胞中也得到了证实。体外辛酸刺激进一步验证了来源于脂肪酸β-氧化的乙酰辅酶A介导了细胞核中的乙酰化稳态。中间代谢物和乙酰转移酶/去乙酰化酶的广泛治疗前景可能为脊椎动物代谢疾病的治疗提供重要见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脂质过剩条件下，乙酰辅酶A是否通过调控p65乙酰化参与炎症反应，其来源和调控机制为何？
- 核心机制
- 高脂饮食增强线粒体脂肪酸β-氧化，产生乙酰辅酶A，经ACLY介导的柠檬酸转运进入细胞核；升高的乙酰辅酶A激活CBP促进p65乙酰化，同时NAD+/NADH下降使SIRT1失活，减少p65去乙酰化，从而增强p65转录活性并加重炎症。
- 主要证据
- 大黄鱼体内高脂饮食模型和体外PA处理鱼肝细胞及AML12细胞，结合LC-MS检测乙酰辅酶A、乙酰化组学、p65位点突变、EMSA、双荧光素酶、免疫共沉淀及抑制剂实验，证明脂肪酸氧化-ACLY-乙酰辅酶A-p65乙酰化轴在鱼类和哺乳动物细胞中介导炎症加重。
- 研究意义
- 该研究首次系统地揭示了脂质过剩下乙酰辅酶A代谢流增加p65乙酰化水平从而加重炎症的潜在机制，为从表观遗传修饰角度理解营养应激诱导代谢疾病提供新见解，并可能为代谢疾病治疗提供中间代谢物和乙酰转移酶/去乙酰化酶的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肝脏乙酰辅酶A水平和乙酰化组学分析
检测高脂饮食对肝脏酰基辅酶A水平及乙酰化修饰图谱的影响，探究乙酰辅酶A与炎症的关联。
使用LC-MS检测肝组织酰基辅酶A水平；通过LC-MS/MS进行乙酰化组学分析，鉴定和定量乙酰化蛋白、肽段和位点，并进行GO和KEGG通路富集分析。
体外验证脂肪酸氧化对p65乙酰化和炎症的调控
验证脂质过剩条件下线粒体脂肪酸β-氧化是否为p65乙酰化提供乙酰辅酶A并促进炎症。
使用棕榈酸（PA）处理大黄鱼原代肝细胞，检测炎症因子表达、p65乙酰化、脂肪酸氧化相关基因和蛋白；使用etomoxir抑制CPT1α，观察对PA诱导的p65乙酰化和炎症的影响；使用乙酸钠处理评估单纯乙酰辅酶A升高的作用。
验证ACLY在乙酰辅酶A转运和炎症中的作用
探究ACLY是否介导乙酰辅酶A从线粒体到细胞核的转运，并参与PA诱导的p65乙酰化和炎症。
检测HFD和PA处理下ACLY Ser455磷酸化水平；使用ACLY抑制剂SB-204990预处理鱼肝细胞，观察对乙酰辅酶A含量、p65乙酰化和炎症因子表达的影响；使用Akt抑制剂MK-2206验证Akt对ACLY的调控。
鉴定调控p65乙酰化的乙酰转移酶和去乙酰化酶
确定在脂质过剩条件下参与p65乙酰化调控的关键KAT和KDAC。
在鱼肝细胞中检测PA处理后KAT和KDAC基因表达变化；在HEK293T细胞中通过双荧光素酶、免疫共沉淀和乙酰化检测验证CBP、PCAF、GCN5和SIRT1对p65的作用；使用CBP抑制剂c646和SIRT1激活剂resveratrol处理鱼肝细胞验证功能。
在哺乳动物细胞系中验证保守性
评估鱼类中发现的脂肪酸氧化-ACLY-p65乙酰化轴在哺乳动物细胞中的保守性。
使用500 μM PA处理AML12细胞24小时建立脂质过剩炎症模型，检测乙酰辅酶A含量、p65乙酰化、炎症因子表达、脂肪酸氧化基因、ACLY磷酸化；使用etomoxir、SB-204990、MB-3和KDAC抑制剂处理验证通路。
辛酸模拟脂肪酸氧化验证核蛋白乙酰化
使用不诱导炎症的辛酸处理，验证脂肪酸氧化是否提供乙酰辅酶A用于核蛋白（组蛋白H3）乙酰化。
使用辛酸处理鱼肝细胞，检测脂肪酸氧化基因表达、MCAD蛋白、组蛋白H3乙酰化、ACLY磷酸化；使用SB-204990、MK-2206、AICAR和resveratrol处理，探究Akt/ACLY和AMPK/SIRT1通路在H3乙酰化中的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白检测 | 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗Akt（磷酸化Ser473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗ACLY（磷酸化Ser455）抗体 | Cell Signaling Technology | 4331 | |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 抗AMPKα（磷酸化Thr172）抗体 | Cell Signaling Technology | 2531 | |
| 乙酰化赖氨酸抗体 | Cell Signaling Technology | 9441 | |
| 抗SIRT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9475 | |
| 抗DYKDDDDK标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 抗ACLY抗体 | Abcam | ab40793 | |
| 抗LCAD抗体 | Abcam | ab196655 | |
| 抗MCAD抗体 | Abcam | ab92461 | |
| 抗CBP抗体 | Wan Lei Bio | WL02842 | |
| 抗PPARα抗体 | Absin | abs117362 | |
| 抗GAPDH抗体 | Golden Bridge Biotechnology | TA-08 | |
| 抗IL-1β抗体 | This paper | -- | |
| 抗COX-2抗体 | Santa Cruz | sc-376861 | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Biological Industries | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 高糖DMEM培养基 | Biological Industries | -- | |
| AML12细胞系 | Procell | CL-0602 | |
| 药物处理 | 棕榈酸 | Merck | P0500; 57-10-3 |
| 依托莫司 | MedChemExpress | HY-50202 | |
| 乙酸钠 | Merck | S2889; 127-09-3 | |
| SB 204990 | MedChemExpress | HY-16450 | |
| MK 2206 | MedChemExpress | HY-10358 | |
| C646 | MedChemExpress | HY-13823 | |
| 白藜芦醇 | MedChemExpress | HY-16561 | |
| KDAC抑制剂 | MedChemExpress | HY-K0030 | |
| AICAR | MedChemExpress | HY-13417 | |
| 辛酸 | Merck | C2875; 124-07-2 | |
| RT-qPCR | SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 |
| 转染 | EZ Trans转染试剂 | LIFE iLAB | AC04L099 |
| KAT活性检测 | HAT活性比色测定试剂盒 | BioVision | K332 |
| NAD+/NADH检测 | EZScreen™ NAD+/NADH比色测定试剂盒 | BioVision | K358 |
| 乙酰辅酶A检测 | 乙酰辅酶A检测试剂盒 | Merck | MAK039 |
| 核蛋白提取 | NE-PER核和细胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78835 |
| 双荧光素酶检测 | 双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒 | TransGen Biotech | FR201 |
| EMSA | LightShift化学发光EMSA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20148 |
| 定点突变 | Mut Express II快速突变试剂盒V2 | Vazyme | C214 |
| 组织生化检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | Applygen Technologies Inc. | -- |
| 血浆生化检测 | ALT/AST检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Inc. | -- |
| 游离脂肪酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Inc. | -- | |
| LC-MS | Thermo Fisher U3000 DGLC液相色谱 | Thermo Fisher | -- |
| SCIEX QTRAP 6500 Plus质谱仪 | SCIEX | -- | |
| 乙酰化组学 | PTMScan乙酰化赖氨酸基序（Ac-K）试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| 反转录 | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- |
| RNA浓度测定 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白浓度测定 | BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| Beyo ECL Plus化学发光试剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 质粒构建 | QuickCut EcoRI限制酶 | Takara | -- |
| ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 双荧光素酶检测 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 免疫沉淀 | Western blotting和IP细胞裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体琼脂糖珠 | Cytoskeleton, Inc. | -- | |
| 免疫共沉淀 | ANTI-Flag M2亲和凝胶 | Sigma | -- |
| 小鼠IgG-琼脂糖 | Sigma | -- | |
| Pierce抗HA琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Flag肽 | MedChem Express | -- | |
| HA肽 | MedChem Express | -- | |
| 动物麻醉 | MS222（三卡因甲磺酸盐） | Sigma | -- |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Biological Industries | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与饮食处理 | 大黄鱼初始体重（15.87±0.14g）、月龄（4个月）、饲养条件（26±2°C，29–32‰盐度，6–7 mg/L溶解氧）、对照组（12%粗脂质）和高脂组（18%粗脂质）饲料成分、饲喂频率（每天两次，10周） 阅读提示：STAR Methods: Animals and diets |
| 原代肝细胞分离与培养 | 肝组织消化方法（0.25%胰蛋白酶10分钟）、培养条件（DMEM/F12+15%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素，28°C）、处理时间（PA 12小时，辛酸12小时） 阅读提示：STAR Methods: Cell culture and reagents |
| AML12细胞培养与处理 | 培养条件（DMEM/F12+10%FBS+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+5ng/mL硒+40ng/mL地塞米松+1%青霉素/链霉素，37°C，5%CO2）、PA浓度（500μM）和处理时间（24小时） 阅读提示：STAR Methods: Cell culture and reagents |
| 药物处理 | 各抑制剂的浓度和孵育时间：etomoxir（CPT1α抑制）、SB-204990（ACLY抑制）、MK-2206（Akt抑制）、c646（CBP抑制）、MB-3（GCN5抑制）、resveratrol（SIRT1激活）、AICAR（AMPK激活）、KDAC inhibitor（广谱），文种未明确说明具体剂量 阅读提示：STAR Methods: Method details; Figure legends 3-7 |
| Western blot分析 | 一抗来源和货号（Key resources table）、二抗孵育条件（1小时）、ECL显色，蛋白条带密度以GAPDH为内参进行标准化 阅读提示：STAR Methods: Western blot analysis |
| 乙酰辅酶A和NAD+/NADH检测 | 乙酰辅酶A测定试剂盒（MAK039）、NAD+/NADH测定试剂盒（K358）、KAT活性试剂盒（K332），检测波长：乙酰辅酶A（λex=535nm, λem=587nm） 阅读提示：STAR Methods: KAT activity, NAD+ and acetyl-CoA measurements |