检测circ_0001821在CRC组织和细胞系中的表达
验证circ_0001821在结直肠癌中是否异常表达
采用RT-qPCR检测44例CRC患者组织和细胞系（SW620、HCT116）中circ_0001821的表达，并与正常组织和正常结肠上皮细胞（NCM460）比较。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
高表达的circ_0001821通过miR-600/ISOC1轴促进结直肠癌进展
High Expression of circ_0001821 Promoted Colorectal Cancer Progression Through miR-600/ISOC1 Axis.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（增殖、迁移、侵袭、凋亡、糖酵解），分子机制验证（双荧光素酶、RNA pull-down），以及体内动物模型验证（异种移植瘤）。
主要模型
结直肠癌组织样本 结直肠癌细胞系SW620和HCT116 正常结肠上皮细胞NCM460 Balb/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
circ_0001821在CRC组织和细胞系中高表达，miR-600低表达 si-circ_0001821转染效率验证 miR-600 inhibitor和ISOC1过表达载体转染效果验证 异种移植瘤模型中sh-circ_0001821敲低效果
摘要
据报道，circRNA在结直肠癌（CRC）的进展中发挥重要的调控作用。然而，circ_0001821在CRC发展中的分子作用尚不清楚。在本研究中，我们旨在探讨circ_0001821在CRC中的调控作用和分子机制。采用逆转录定量PCR和western blot检测circ_0001821、miR-600和异分支酸酶结构域包含1（ISOC1）在CRC组织及其细胞系中的表达。采用集落形成实验和EDU实验检测细胞增殖能力。Transwell实验用于评估细胞迁移和侵袭能力。流式细胞术用于分析细胞凋亡。ELISA用于测量细胞的糖酵解能力。双荧光素酶报告基因实验和RNA pull-down实验用于分析circ_0001821、miR-600和ISOC1之间的关系。动物实验用于验证circ_0001821在体内的功能研究。免疫组织化学（IHC）Ki67染色分析评估肿瘤生长。circ_0001821和ISOC1在CRC组织及其细胞系中显著升高，而miR-600在CRC组织及其细胞系中显著降低。沉默circ_0001821抑制细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解能力，同时诱导凋亡。并且它可以在体内抑制肿瘤生长。Circ_0001821可以作为miR-600的海绵来调节CRC进程。ISOC1被鉴定为miR-600的下游调控因子，miR-600也可以调控ISOC1的表达。此外，circ_0001821可以通过miR-600调控ISOC1的表达变化。机制上，miR-600抑制剂或ISOC1过表达都可以逆转敲低circ_0001821对细胞生物学特性的影响。Circ_0001821通过miR-600/ISOC1轴调控CRC的发育过程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circ_0001821在结直肠癌进展中的表达、功能及分子机制尚不清楚，本研究旨在探讨其调控作用和机制。
- 核心机制
- circ_0001821作为miR-600的海绵，吸附miR-600，从而上调其靶基因ISOC1的表达，通过miR-600/ISOC1轴促进结直肠癌的进展。
- 主要证据
- 在CRC组织、细胞系中验证circ_0001821高表达；沉默circ_0001821抑制细胞增殖、迁移、侵袭、糖酵解并诱导凋亡；双荧光素酶和RNA pull-down证明circ_0001821与miR-600结合；miR-600 inhibitor或ISOC1过表达逆转沉默circ_0001821的表型；体内实验证明沉默circ_0001821抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- circ_0001821可作为结直肠癌的分子标志物，为更早、更有效地确诊CRC提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验：沉默circ_0001821对细胞生物学特性的影响
评估circ_0001821对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和糖酵解的影响
在SW620和HCT116细胞中转染si-circ_0001821，通过集落形成、EDU、Transwell、流式细胞术、葡萄糖摄取和乳酸产生实验检测细胞功能，并通过western blot检测PCNA、MMP2、Bax、HK2蛋白表达。
验证circ_0001821与miR-600的相互作用
确认circ_0001821是否作为miR-600的海绵
通过circinteractome预测miR-600为circ_0001821的靶标，采用双荧光素酶报告实验和RNA pull-down验证结合，并分析两者表达的相关性。
验证miR-600对ISOC1的靶向调控
确认ISOC1是miR-600的下游靶基因
通过TargetScan预测ISOC1为miR-600靶基因，双荧光素酶报告实验验证结合，RT-qPCR和western blot检测ISOC1表达，并分析miR-600与ISOC1表达相关性。
救援实验：miR-600 inhibitor或ISOC1过表达对circ_0001821敲低效应的逆转
验证circ_0001821通过miR-600/ISOC1轴发挥作用
在SW620和HCT116中共转染si-circ_0001821与anti-miR-600或ISOC1过表达载体，检测细胞功能（增殖、迁移、侵袭、凋亡、糖酵解）和蛋白表达。
体内实验：沉默circ_0001821对肿瘤生长的影响
验证circ_0001821在体内对肿瘤生长的作用
使用sh-circ_0001821慢病毒感染SW620细胞，皮下注射至裸鼠，定期测量肿瘤体积，第35天处死称重，IHC检测Ki67表达，RT-qPCR和western blot检测circ_0001821、miR-600和ISOC1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 逆转录 | 第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen | 11119ES60 |
| miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen | 11148ES10 | |
| RT-qPCR | SYBR Green混合液 | Yeasen | 11202ES03 |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Sangon | A100528-0025 |
| EDU实验 | EDU细胞增殖检测试剂盒 | Ribobio | C10310-1 |
| DAPI染色液 | Leagene | DA0001 | |
| Transwell实验 | 基质胶 | Corning Incorporated | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Solarbio | CA1020 |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖摄取检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK083 |
| 乳酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK064 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| SDS-PAGE凝胶 | Beyotime | P0670 | |
| PVDF膜 | Beyotime | FFP33 | |
| ECL化学发光试剂 | Unique | 32132 | |
| 抗PCNA抗体 | Abcam | ab29 | |
| 抗MMP2抗体 | Abcam | ab92536 | |
| 抗Bax抗体 | Abcam | ab32503 | |
| 抗HK2抗体 | Abcam | ab209847 | |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 抗ISOC1抗体 | Biorbyt | orb400332 | |
| 二抗 | Abcam | ab205718 | |
| 二抗 | Abcam | ab205719 | |
| 双荧光素酶报告实验 | pmirGLO载体 | Promega | -- |
| RNA pull-down | RNA pull-down试剂盒 | Gzscbio | KT103-01 |
| 动物实验 | Balb/c小鼠 | Vital River | -- |
| 免疫组化 | 苏木素 | Sigma-Aldrich | H9627 |
| 抗Ki-67抗体 | Abcam | 1:200 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本检测 | CRC组织样本量（44例）、正常组织来源、circ_0001821表达水平 阅读提示：Materials and Methods - Tissue Specimens; Results - Circ_0001821 was UpRegulated in CRC Tissues (Fig. 1B) |
| 细胞系培养和转染 | 细胞系（SW620、HCT116、NCM460）来源，培养基（RPMI 1640，10% FBS），培养条件（37°C，5% CO2），转染试剂（Lipofectamine 3000）和siRNA序列 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture, Cell Transfections; Table 1 |
| 细胞功能实验 | 转染浓度和时间，集落形成（5×10^3细胞/孔，12天），EDU（8×10^4细胞/孔，3小时），Transwell（24小时），凋亡检测（5μL Annexin V-FITC和PI，30分钟），糖酵解检测（细胞密度和时间） 阅读提示：Materials and Methods - Colony Formation Assay, EDU Assay, Transwell Assay, Flow Cytometry, Glucose Uptake, Lactate Production Levels Assay; Results相应图注 |
| 分子机制验证 | 双荧光素酶报告载体（WT/MUT）构建，RNA pull-down实验步骤，miR-600 inhibitor和mimic浓度 阅读提示：Materials and Methods - Dual-Luciferase Reporter Assay, RNA Pull-Down Assay; Results - Circ_0001821 Acted as a Sponge for miR-600, ISOC1 was the Target Gene of miR-600 |
| 体内动物实验 | 小鼠品系（Balb/c裸鼠，6周龄）来源，细胞接种密度，shRNA序列，肿瘤体积测量间隔（7天），终点时间（35天） 阅读提示：Materials and Methods - Animal Experimentation; Results - Circ_0001821 Silencing Hampered Tumor Growth In Vivo |