患者血浆代谢组学分析
鉴定pre-B ALL患儿与健康儿童外周血血浆中差异代谢物，寻找潜在生物标志物。
采集27例初诊pre-B ALL患儿和27例健康对照的外周血血浆，进行非靶向代谢组学分析，发现1,5-AG水平在患儿中升高。
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1,5-脱水葡萄糖醇通过驱动糖酵解和活性氧形成促进前B急性淋巴细胞白血病的进展
1,5-Anhydroglucitol promotes pre-B acute lymphocytic leukemia progression by driving glycolysis and reactive oxygen species formation.
实验完整度
高包含患者血浆代谢组学、细胞系功能实验、siRNA敲低PDK4机制验证、体内异种移植模型（IVIS、流式）等多层级证据。
主要模型
pre-B ALL细胞系Reh和HAL-01 “人源化小鼠”异种移植白血病模型（NPI小鼠） pre-B ALL患者外周血单个核细胞（PB-MNCs）
重点核对
1,5-AG处理浓度梯度（0.2-4 mM）及作用时间（12、24小时） NAC浓度（2 mM）和维生素C浓度（0.2 mM）联合处理 siPDK4敲低序列（siPDK4-1、siPDK4-2）及其效果验证 动物模型分组：空白、模型、NAC、1,5-AG、1,5-AG+NAC，每组5只小鼠 检测时间点：体内成像第4、7天，小鼠在第7天取材
摘要
背景：前体B细胞急性淋巴细胞白血病（pre-B ALL）是儿童中最常见的血液系统恶性肿瘤。细胞代谢重组与白血病的进展和治疗密切相关。我们发现，结构类似于葡萄糖的1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）在pre-B ALL患儿中水平升高。然而，1,5-AG对pre-B ALL的作用尚不清楚。在此，我们旨在揭示1,5-AG在pre-B ALL进展中的作用和机制。方法：使用非靶向代谢组学分析检测初诊pre-B ALL患儿和健康儿童的外周血血浆水平。使用pre-B ALL细胞系Reh和HAL-01进行了Cell Counting Kit-8实验、RNA测序、siRNA转染、实时定量PCR和Western blot。使用流式细胞术评估细胞周期、细胞凋亡、ROS水平以及CD19阳性率。使用XFe24细胞外通量分析仪测量耗氧率和细胞外酸化率。使用试剂盒测量乳酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水平。使用体内成像系统在异种移植白血病模型中验证了1,5-AG对pre-B ALL进展的影响。结果：我们证实1,5-AG促进了pre-B ALL细胞的增殖、活力和细胞内糖酵解。机制上，1,5-AG通过上调丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）促进糖酵解，同时抑制线粒体呼吸。此外，高水平的细胞内糖酵解通过激活活性氧（ROS）依赖的丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）通路促进pre-B ALL进展。相反，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸或维生素C有效抑制了1,5-AG介导的白血病细胞进展。结论：我们的研究揭示了1,5-AG在pre-B ALL中以前未被发现的作用，这有助于深入理解pre-B ALL进展中的无氧糖酵解，并为pre-B ALL的临床治疗提供了新的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）在pre-B ALL进展中的作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- 1,5-AG通过上调PDK4增加无氧糖酵解并抑制线粒体呼吸，促进细胞内ROS积累，进而激活ROS依赖的MAPK/ERK信号通路，促进pre-B ALL细胞增殖和疾病进展。
- 主要证据
- 通过患者血浆代谢组学发现1,5-AG升高；在Reh和HAL-01细胞系及患者PB-MNC中，1,5-AG促进细胞活力、细胞周期S期进展和糖酵解，并增加ROS；siPDK4敲低逆转了这些效应；体内模型中1,5-AG增加白血病负荷，而NAC部分逆转了这些效应。
- 研究意义
- 研究首次报道1,5-AG影响糖酵解和白血病细胞生长，提示1,5-AG可作为pre-B ALL的生物标志物，并为高1,5-AG的pre-B ALL儿童提供了潜在的抗氧化剂治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞功能实验
验证1,5-AG对pre-B ALL细胞增殖、活力、凋亡和周期的影响。
用不同浓度1,5-AG处理Reh和HAL-01细胞，通过CCK-8检测细胞活力，用流式细胞术检测细胞周期和凋亡。
糖酵解和氧化应激检测
探究1,5-AG对糖酵解和ROS水平的影响。
使用Seahorse分析仪测量ECAR和OCR，检测乳酸和NADPH水平，并用DCFH-DA探针检测ROS。
机制验证：PDK4敲低
验证PDK4是否介导1,5-AG对糖酵解和线粒体呼吸的作用。
使用siRNA敲低PDK4，检测细胞活力、乳酸水平、OCR和ECAR变化。
患者样本验证
在pre-B ALL患者PB-MNC中验证1,5-AG的作用。
从3例pre-B ALL患者分离PB-MNC，处理不同浓度1,5-AG，检测细胞活力和ROS水平。
体内异种移植模型验证
在体内评估1,5-AG对白血病进展的影响以及NAC的逆转效果。
将mCherry标记的Reh细胞移植至NPI小鼠，分组给予1,5-AG和/或NAC，通过IVIS、脾脏重量和流式检测评估白血病负荷。
通路验证：MAPK/ERK
探究1,5-AG介导的ROS是否激活MAPK/ERK通路。
通过Western blot检测ERK1/2磷酸化水平，并用抗氧化剂NAC和维生素C验证其逆转作用，在体内通过免疫组化检测p-ERK1/2。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 代谢组学分析 | Integrated SpeedVac 系统 | Thermo Fisher Scientific | ISS110-230 |
| 1,5-AG 标准品 | Jkchemical | 309,742 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640 培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 1,5-脱水葡萄糖醇 | -- | -- | |
| 维生素C | Sigma Aldrich | A92902 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma Aldrich | A7250 | |
| 嘌呤霉素 | Beyotime | ST551 | |
| Ficoll 密度梯度分离液 | -- | -- | |
| GSDetect Taqman 支原体检测试剂盒 | Guangzhou Geneseed Biotech Co. | D0102 | |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen | 11,668,500 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8 细胞活力检测试剂盒 | Dojindo | CK04-500T |
| 流式细胞术 | 抗人CD19抗体（APC/PE） | Biolegend | 302,212 / 982,402 |
| Guava easyCyte 6HT 流式细胞仪 | EMD Millipore | -- | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | BD Biosciences | 550,825 |
| RNase A（10 mg/mL） | Solarbio | R1030 | |
| 细胞凋亡检测 | FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 556,547 |
| 细胞能量代谢分析 | Seahorse XF 细胞线粒体压力检测试剂盒 | Agilent Technologies | 103015-100 |
| Seahorse XF 糖酵解速率检测试剂盒 | Agilent Technologies | 103344-100 | |
| Seahorse XFe24 细胞外通量分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Cell-Tak 细胞粘附剂 | BD Biosciences | 354,240 | |
| 乳酸检测 | 乳酸比色检测试剂盒 | Solarbio | BC2230 |
| NADPH检测 | NADP+/NADPH 检测试剂盒 | Beyotime | S0179 |
| ROS检测 | DCFH-DA 荧光探针 | Beyotime | S0033S |
| RNA提取 | TRIzol 试剂 | Sigma Aldrich | T9424-100mL |
| RNAfast2000 提取试剂盒 | Fastagen | 220,011 | |
| RT-qPCR | ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 试剂盒 | TOYOBO | FSQ-201 |
| SYBR Green 实时PCR预混液 | TOYOBO | QPK-201 | |
| 实时热循环仪（qTOWER3G） | Analytik Jena AG | qTOWER3G | |
| Western blot | RIPA 裂解液 | Solarbio | R0020 |
| 磷酸酶/蛋白酶抑制剂 | Beyotime | P1005 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174S | |
| 抗PDK4抗体 | Proteintech | 12949-1-AP | |
| 抗p44/42 MAPK（ERK1/2）抗体 | Cell Signaling Technology | 4695S | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| 山羊抗兔二抗 | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| 增强化学发光检测系统 | JIAPENG | JP-K600plus | |
| 免疫组化 | 显微镜（RVL2-K） | ECHO | RVL2-K |
| ECHO Pro v6.3 图像采集软件 | ECHO | -- | |
| 体内成像 | IVIS Spectrum 活体成像系统 | PerkinElmer Inc. | -- |
| 流式分析软件 | Guava Incyte 软件（3.1版） | EMD Millipore | -- |
| 图像分析 | ImageJ 软件 | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者血浆代谢组学 | 样本量（27例患者和27例对照）、采样时间（初诊化疗前）、血浆提取方法（离心1800×g，4°C，15分钟） 阅读提示：Methods: Patients and extraction of peripheral blood plasma; Figure 1 |
| 细胞培养和处理 | 细胞系（Reh和HAL-01）、培养基（RPMI-1640+10% FBS+1% 青霉素-链霉素）、1,5-AG浓度梯度（0.2-4 mM）、处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Cell culture, Cell viability assay; Figure 2 |
| 细胞功能检测 | CCK-8实验、细胞周期（PI染色）、凋亡（Annexin V）、ROS检测（DCFH-DA浓度10 μM，孵育20分钟） 阅读提示：Methods: Cell viability assay, Cell cycle and cell apoptosis analyses, Detection of ROS; Figure 2, 4 |
| 糖酵解和线粒体呼吸检测 | Seahorse XFe24分析仪、细胞密度（Reh 6×10^5/孔，HAL-01 8×10^5/孔）、试剂盒（Mito Stress Test Kit和Glycolytic Rate Assay Kit） 阅读提示：Methods: XFe24 Extracellular Flux Analyzer; Figure 2D-E |
| PDK4敲低 | siRNA序列（siPDK4-1、siPDK4-2）和转染试剂（Lipofectamine 2000）、敲低效率验证（RT-qPCR和Western blot） 阅读提示：Methods: siRNA transfection, Western blotting; Figure 3 |
| 体内异种移植模型 | 小鼠品系（NPI）、细胞数（4×10^6）、分组（5组，每组5只）、给药方案（1,5-AG灌胃100 μL 100 mM；NAC 75 mg/kg/day）、检测时间点（第4、7天） 阅读提示：Methods: Animal procedures; Figure 5 |
| MAPK/ERK通路验证 | 抗体（p-ERK1/2 #4370S和ERK1/2 #4695S）浓度（1:2000）、处理（1,5-AG 0.8 mM，NAC 2 mM，维生素C 0.2 mM） 阅读提示：Methods: Western blotting; Figure 6 |