DHX9表达分析
检测DHX9在oxLDL或IFN-γ处理的巨噬细胞和CAD患者PBMCs中的表达变化。
通过Western blot和免疫荧光检测DHX9蛋白表达，以及利用公共单细胞RNA测序数据分析和qPCR检测mRNA。
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DHX9通过促进巨噬细胞炎症反应加剧动脉粥样硬化进展
DHX9 Strengthens Atherosclerosis Progression By Promoting Inflammation in Macrophages.
实验完整度
高包含体外细胞实验（THP-1巨噬细胞、PBMCs）、体内动物模型（ApoE-/-小鼠）和患者样本，并通过功能验证（脂质摄取、炎症因子、黏附）及机制验证（Co-IP、ChIP）支持结论。
主要模型
THP-1来源的巨噬细胞 CAD患者外周血单核细胞（PBMCs） ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型 HUVECs（用于单核细胞黏附实验）
重点核对
DHX9敲低效率：siRNA转染或AAV-sh-DHX9注射后验证mRNA和蛋白水平 oxLDL处理浓度和时间：40 μg/mL，24小时（部分实验使用80 μg/mL） IFN-γ处理浓度和时间：20 ng/mL，不同时间点 动物模型建立：ApoE-/-小鼠，7周龄，尾静脉注射AAV，1周后高脂饮食12周 检测指标：脂质摄取（DiI-oxLDL）、炎症因子表达（IL-6、TNF-α）、p65活化、ChIP分析IL-6启动子结合
摘要
动脉粥样硬化（AS）是脑血管疾病的主要原因，巨噬细胞在动脉粥样硬化中发挥重要作用。DExH-Box解旋酶9（DHX9）作为DExD/H-box RNA解旋酶超家族II的成员，被鉴定为系统性红斑狼疮患者血清中的自身抗原，可触发炎症。本研究旨在探讨DHX9是否参与AS的发展，尤其是在巨噬细胞介导的炎症反应中。我们发现，在oxLDL或干扰素-γ处理的巨噬细胞以及冠状动脉疾病（CAD）患者的外周血单核细胞（PBMCs）中，DHX9的表达显著增加。敲低DHX9可抑制巨噬细胞的脂质摄取和促炎因子表达，并改善TNF-α介导的单核细胞黏附能力。此外，我们发现oxLDL刺激促进巨噬细胞中DHX9与p65的相互作用，并进一步增强DHX9-p65-RNA聚合酶II复合物的转录活性以产生炎症因子。此外，使用ApoE-/-小鼠喂食西方饮食建立AS模型，我们发现通过尾静脉注射AAV-Sh-DHX9介导的DHX9敲低明显减轻了体内AS进展。最后，我们还发现，在CAD患者的PBMCs中，敲低DHX9抑制p65活化、炎症因子表达以及p65-RNA聚合酶II复合物的转录活性。总之，这些结果表明DHX9通过增强巨噬细胞炎症反应促进AS进展，并提示DHX9可能是开发治疗药物的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DHX9是否参与动脉粥样硬化发展，尤其是通过巨噬细胞介导的炎症反应？
- 核心机制
- DHX9在oxLDL刺激的巨噬细胞中与p65相互作用，形成DHX9-p65-RNA聚合酶II复合物，增强IL-6等炎症因子的转录活性。
- 主要证据
- 在THP-1巨噬细胞和CAD患者PBMCs中，敲低DHX9抑制p65活化、炎症因子表达及p65-RNA聚合酶II复合物结合IL-6启动子；在ApoE-/-小鼠模型中，敲低DHX9减轻动脉粥样硬化病变。
- 研究意义
- DHX9可能成为开发动脉粥样硬化治疗药物的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低DHX9对巨噬细胞功能的影响
验证DHX9对巨噬细胞脂质摄取、炎症因子表达及单核细胞黏附的影响。
使用siRNA敲低DHX9，检测DiI-oxLDL摄取、炎症因子mRNA表达（IL-6、TNF-α、IL-1β）以及TNF-α诱导的THP-1细胞黏附到HUVECs的能力。
DHX9与p65相互作用及信号通路分析
探究oxLDL刺激下DHX9是否与p65相互作用并影响NF-κB信号通路。
通过Western blot检测MAPK和NF-κB通路蛋白，Co-IP检测DHX9与p65的结合，免疫荧光观察共定位，天然PAGE检测p65二聚体形成。
转录活性分析
验证oxLDL促进DHX9-p65-RNA聚合酶II复合物与IL-6启动子结合。
使用ChIP和ChIP-re-ChIP分析DHX9、p65、RNA聚合酶II在IL-6启动子的结合，以及敲低DHX9后的变化。
体内验证
评估敲低DHX9对动脉粥样硬化小鼠模型的影响。
ApoE-/-小鼠通过尾静脉注射AAV-sh-DHX9或对照，喂食西方饮食建立AS模型，检测动脉病变面积、巨噬细胞中p65活化、炎症因子表达。
患者PBMCs验证
验证在CAD患者PBMCs中敲低DHX9的效果。
从CAD患者分离PBMCs，转染si-DHX9，检测p-p65、炎症因子mRNA以及ChIP分析IL-6启动子结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 佛波酯 | Sigma | -- | |
| 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 干扰素-γ | BioLegend | -- | |
| 氧化低密度脂蛋白 | Beyotime | -- | |
| 重组人肿瘤坏死因子-α | Beyotime | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| DHX9抗体 | Proteintech | 17721-1-AP | |
| STAT1抗体 | Proteintech | 10144-2-AP | |
| 磷酸化STAT1 (Ser727)抗体 | Active motif | 39634 | |
| p38抗体 | Proteintech | 14064-1-AP | |
| 磷酸化p38 MAPK抗体 | Proteintech | 28796-1-AP | |
| JNK抗体 | Proteintech | 66210-1-Ig | |
| 磷酸化JNK抗体 | Proteintech | 80024-1-RR | |
| ERK1/2抗体 | Proteintech | 11257-1-AP | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Proteintech | 80031-1-RR | |
| p65抗体 | Proteintech | 66535-1-Ig | |
| 磷酸化p65 (S536)抗体 | Santa Cruz | sc-136548 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| flag抗体 | Proteintech | ab205606 | |
| Lamin B1抗体 | Proteintech | 66095-1-Ig | |
| ECL化学发光试剂盒 | Pierce | -- | |
| 免疫荧光 | F4/80抗体 | Proteintech | 28463-1-AP |
| DAPI | Cell Signaling | -- | |
| 蔡司LSM 800共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 转染 | DHX9 siRNA | GenePharma | -- |
| pCMV3-N-FLAG-DHX9质粒 | Sino Biological | -- | |
| jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- | |
| 动物实验 | AAV-GP-3-sh-DHX9 | GenePharma | -- |
| ELISA | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Abcam | ab208348 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Abcam | ab222503 | |
| 脂质摄取实验 | DiI标记氧化低密度脂蛋白 | YEASEN | 20609ES76 |
| 黏附实验 | 钙黄绿素AM | Sigma-Aldrich | -- |
| 流式分析 | Annexin V-PE凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1065M |
| 细胞周期分析试剂盒 | Beyotime | C1052 | |
| 流式细胞仪 | Beckman | -- | |
| 细胞核质分离 | 核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0027 |
| ChIP | SimpleChIP®酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| p65抗体 | Abcam | ab32536 | |
| RNA聚合酶II抗体 | Abcam | ab264350 | |
| 动物实验 | 油红O | Beyotime | -- |
| 细胞培养 | 人淋巴细胞分离液 | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和分化 | THP-1细胞使用PMA分化浓度和时长；PBMCs使用GM-CSF浓度和培养时间 阅读提示：见Methods 'Cell Culture' |
| siRNA转染 | siRNA序列和转染试剂用量；转染时间 阅读提示：见Methods 'Plasmids, Small Interfering RNAs (siRNAs) and Adeno-associated Virus' |
| oxLDL处理 | oxLDL浓度（通常40 μg/mL）和处理时间（24小时） 阅读提示：见Results 'DHX9 Expression is Significantly Increased...'及图例 |
| IFN-γ处理 | IFN-γ浓度（20 ng/mL）和处理时间 阅读提示：见Results 'DHX9 Expression is Significantly Increased...'及图例 |
| 动物实验 | ApoE-/-小鼠周龄和性别；AAV注射剂量和途径；高脂饮食持续时间 阅读提示：见Methods 'Animal Experiments' |
| ChIP实验 | 抗体选择（DHX9, p65, RNA Pol II）；使用的试剂盒；引物序列 阅读提示：见Methods 'Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assays' |
| 患者PBMCs处理 | 患者纳入标准；PBMCs分离方法；转染条件 阅读提示：见Methods 'Human Peripheral Blood Samples'和'Cell Culture' |