单细胞转录组图谱构建
识别小梁网组织的细胞组成及老化过程中的分子变化。
对6只猕猴（3只年轻、3只年老）的小梁网进行单细胞RNA测序，通过聚类分析识别12种细胞亚型和13个TMC亚簇。
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衰老猕猴眼流出组织的单细胞转录组图谱
Single-cell transcriptomic Atlas of aging macaque ocular outflow tissues.
实验完整度
高包含scRNA-seq、细胞衰老模型、siRNA敲低、小鼠体内模型及功能验证，涉及体外细胞和体内动物等多个证据层级。
主要模型
原代人小梁网细胞（TMCs） U937细胞系（巨噬细胞模型） C57BL/6J小鼠（3月龄和23月龄）
重点核对
scRNA-seq样本：6只猕猴，年轻组3只（13-17岁），年老组3只（25-26岁） TMC衰老诱导：H2O2浓度50-100 μmol/L处理2小时 APOE siRNA转染：浓度50 nmol/L，转染24小时 小鼠APOE抑制：COG 133 TFA（1 mg/kg，腹腔注射，每两天一次，共28天） 验证方法：Western blot、qRT-PCR、流式细胞术、Transwell迁移实验
摘要
小梁网（TM）的进行性退化与年龄相关的眼部疾病如原发性开角型青光眼有关。然而，TM老化过程的分子基础和生物学意义尚未完全阐明。在这里，我们建立了衰老猕猴TM的动态单细胞转录组图谱，其中我们将流出组织分类为12种细胞亚型，并确定线粒体功能障碍是TM老化的一个显著特征。此外，我们将TM细胞分为13个簇，并对簇0进行了深入分析，其老化评分最高，且两组间细胞比例变化最显著。最终，我们发现APOE基因是簇0在老化过程中的一个重要差异表达基因，突出了细胞迁移和细胞外基质调节与TM功能之间的密切关系。我们的工作进一步证明，沉默APOE基因可以通过解除对PI3K-AKT通路的抑制并下调细胞外基质成分的表达来增加迁移并减少凋亡，从而增加房水流出率并将眼压维持在正常范围内。我们的工作为未来青光眼的临床诊断和治疗提供了宝贵的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小梁网组织随年龄增长发生哪些分子变化，以及APOE基因是否通过特定机制促进小梁网老化并影响青光眼发病。
- 核心机制
- APOE通过抑制PI3K-AKT信号通路，促进细胞凋亡、增加细胞外基质沉积，并抑制细胞迁移，从而加速小梁网老化。
- 主要证据
- scRNA-seq揭示APOE在老化小梁网中上调；体外TMC和U937细胞实验及小鼠模型中，APOE敲低或抑制后，PI3K-AKT通路激活，凋亡减少，ECM成分下调，房水流出改善。
- 研究意义
- 该研究为理解青光眼病理机制提供了新见解，并表明APOE可作为青光眼及其他小梁网相关疾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TMC衰老模型建立
验证原代TMC衰老模型的建立及衰老标志物表达。
使用H2O2处理原代TMC诱导衰老，通过SA-β-gal染色、免疫荧光和Western blot检测衰老标志物。
APOE功能验证（体外）
验证APOE对衰老TMC的迁移、凋亡和ECM调节功能的影响。
通过siRNA敲低TMC中APOE表达，检测细胞周期、迁移能力、凋亡率以及ECM和PI3K-AKT通路蛋白表达。
APOE抑制的体内验证
在老年小鼠中评估APOE抑制对小梁网功能和形态的影响。
对23月龄小鼠腹腔注射APOE抑制剂COG 133，通过Gd-MRI评估房水流出，并通过免疫荧光、Western blot、H&E和TEM分析组织变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | TMCM培养基 | ScienCell | -- |
| 胎牛血清 | ScienCell | -- | |
| 青霉素/链霉素 | ScienCell | -- | |
| TM细胞生长补充剂 | ScienCell | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Procell | 164210-50 | |
| 青霉素/链霉素 | Procell | PB180120 | |
| 药物处理 | COG 133 TFA | MedChemExpress | HY-P1050A |
| 细胞衰老诱导 | 过氧化氢 | -- | -- |
| 4β-佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| siRNA转染 | APOE siRNA | Ribobio | -- |
| 阴性对照siRNA | Ribobio | -- | |
| riboFECT™ CP转染试剂盒 | Ribobio | C10511-05 | |
| SA-β-gal染色 | SA-β-gal染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| GoScript™逆转录系统 | Promega | A5000 | |
| PowerUp™ SYBR™ Green预混液 | Applied Biosystems | A25742 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo | -- |
| 化学发光试剂盒 | CWBIO | -- | |
| APOE抗体 | Cell Signaling Technology | 13366 | |
| β-半乳糖苷酶抗体 | Cell Signaling Technology | 27198 | |
| CLU抗体 | Proteintech | 12289-1-AP | |
| VEGFA抗体 | Proteintech | 19003-1-AP | |
| P21抗体 | Proteintech | 10355-1-AP | |
| 层粘连蛋白抗体 | Proteintech | 23498-1-AP | |
| CD44抗体 | Proteintech | 15675-1-AP | |
| PI3K抗体 | Proteintech | 60225-1-Ig | |
| AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| p-AKT抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | |
| caspase 3抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| caspase 9抗体 | Proteintech | 10380-1-AP | |
| p-PI3K抗体 | Abways | CY6427 | |
| 纤连蛋白抗体 | Abcam | ab32419 | |
| α-SMA抗体 | Sigma-Aldrich | A5228 | |
| 免疫荧光 | TIMP3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| Alexa Fluor 488偶联二抗 | Invitrogen | -- | |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Invitrogen | -- | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 迁移实验 | Transwell小室 | Corning Costar | -- |
| DMEM/F12培养基 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| 结晶紫 | Leagene Biotechnology | DM0119 | |
| 细胞周期 | 细胞周期检测试剂盒 | Keygen Biotech | KGA-511 |
| 细胞凋亡 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Vazyme | A211-01 |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 |
| AS-OCT | 超显微眼科成像系统 | Heidelberg Engineering | -- |
| 三溴乙醇 | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Gd-MRI | 钆喷酸葡胺 | -- | -- |
| 组织包埋 | Tissue-Tek O.C.T.包埋剂 | SAKURA | -- |
| 免疫荧光 | 牛血清白蛋白 | Servicebio | GC305006 |
| 细胞培养 | U937细胞系 | Procell Life Science & Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6J；年龄：3月龄和23月龄；性别：雄性；饲养条件：SPF级，12小时光暗循环，湿度40%-60%，温度19-22°C 阅读提示：Methods - Mice |
| 细胞衰老诱导 | H2O2处理浓度：50-100 μmol/L，处理时间：2小时；U937细胞分化：PMA浓度100 ng/mL处理24小时，随后LPS刺激浓度1 μg/mL 阅读提示：Methods - Induction of TMCs senescence及Induction of U937 cell line senescence |
| APOE敲低 | siRNA浓度：50 nmol/L，转染时间：24小时；使用riboFECT™ CP转染试剂盒遵循制造商说明 阅读提示：Methods - Small interfering RNA |
| 动物给药 | APOE抑制剂COG 133 TFA剂量：1 mg/kg，腹腔注射，每两天一次，持续28天；对照组：等量无菌PBS 阅读提示：Methods - Mice |
| 功能检测 | Gd-MRI：Gd-DTPA剂量0.3 mmol/kg，扫描参数（视野14.4×14.4 mm2，重复时间/回波时间600/9 ms，平面分辨率256×256 μm2）；Transwell迁移实验：每孔5×10^4个TMC，使用无血清DMEM/F12培养基 阅读提示：Methods - Gadolinium magnetic resonance imaging及Migration assay |