RB与TRIM24的相互作用及其对TRIM24转录活性的影响
探索RB是否与TRIM24结合并调控其转录活性。
分析ChIP-seq数据，通过co-IP验证内源性RB/TRIM24/TRIM28相互作用；敲低TRIM24或RB后进行RNA-seq和CUT&Tag分析，检测mTOR通路相关基因表达及TRIM24在靶基因启动子上的结合变化。
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视网膜母细胞瘤相关蛋白通过DUSP2作用对TRIM24介导的前列腺癌mTOR信号通路激活至关重要
Retinoblastoma-associated protein is important for TRIM24-mediated activation of the mTOR signaling pathway through DUSP2 action in prostate cancer.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内PDX及细胞系移植瘤模型、临床组织芯片分析、多组学分析（RNA-seq、CUT&Tag、ChIP-seq）、蛋白质互作及功能验证。
主要模型
C4-2细胞 22Rv1细胞 DU145细胞 PC-3细胞 前列腺癌患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型 C4-2细胞异种移植小鼠模型
重点核对
RB-S249/T252与TRIM24的924FQDPV928基序结合的关键性 RB/TRIM24复合物通过KLF3抑制DUSP2表达，激活ERK和mTOR通路的信号轴 R-linker-PROTAC降解TRIM24和p65的蛋白水平（而非mRNA水平） R-linker-PROTAC与RAD001联用在体内外的抗肿瘤效果
摘要
RB转录共抑制因子1（RB）缺失是接受雄激素受体（AR）信号抑制剂治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者预后相关的最重要的基因组因素。RB缺失可能以不依赖激素的方式支持前列腺癌细胞生长，但RB调控肿瘤进展的潜在机制远不止细胞周期通路。既往研究表明，RB使AKT信号失活，但对癌细胞中的mTOR信号没有影响。在这里，我们通过FXXXV映射发现，RB中的S249/T252位点是调控CRPC中促肿瘤因子TRIM24转录活性的关键。RB/TRIM24复合物通过DUSP2（作为中间桥梁）发挥作用，激活mTOR通路并促进前列腺癌进展。因此，我们设计了RB-linker-蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）分子，该分子降低TRIM24蛋白水平并使mTOR信号通路失活，从而抑制前列腺癌。因此，本研究不仅阐明了RB的新功能，也为开发治疗前列腺癌的新药提供了理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RB是否以及如何通过调控TRIM24的功能来影响前列腺癌的进展，以及能否利用该机制设计靶向治疗策略。
- 核心机制
- RB通过其N端S249/T252位点识别TRIM24的FXXXV基序，增强TRIM24的转录活性；RB/TRIM24复合物通过转录因子KLF3结合DUSP2启动子，抑制DUSP2表达，进而解除DUSP2对ERK的抑制，激活ERK信号通路，最终激活mTOR信号通路，促进前列腺癌进展。
- 主要证据
- 通过GST pull-down、co-IP、CUT&Tag、RNA-seq及ChIP实验证实RB与TRIM24相互作用并调控DUSP2；在C4-2和22Rv1细胞中验证TRIM24对DUSP2/ERK/S6K1信号的影响；体内PDX和C4-2异种移植模型显示R-linker-PROTAC降解TRIM24并增强RAD001的抗肿瘤效果。
- 研究意义
- 本研究揭示了RB非经典功能，为开发靶向'FXXXV'序列的PROTAC新药治疗前列腺癌提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RB与TRIM24结合的结构基础及磷酸化调控
明确RB与TRIM24结合的具体区域和磷酸化依赖性。
通过GST pull-down定位RB的N端（1-379 aa）与TRIM24的C端（794-1050 aa）相互作用；构建TRIM24的FQDPV缺失突变体和RB的磷酸化位点突变体，用CDK4/6抑制剂处理细胞，通过co-IP检测突变对结合的影响。
RB/TRIM24复合物对mTOR信号通路的调控及临床相关性
验证RB/TRIM24复合物是否通过mTOR信号影响前列腺癌细胞功能。
过表达HA-RBN或TRIM24，敲低TRIM24，检测pS6K1 T389水平及对RAD001的敏感性；利用组织芯片进行IHC染色，分析TRIM24与pS6K1 T389的相关性。
DUSP2介导RB/TRIM24复合物激活mTOR信号通路
阐明RB/TRIM24复合物激活mTOR信号通路的中间机制，验证DUSP2的关键作用。
通过CUT&Tag分析RB/TRIM24调控的下游通路，检测TRIM24对DUSP2表达和ERK磷酸化的影响；通过ChIP、ChIP-re-ChIP和报告基因实验验证RB/TRIM24复合物通过KLF3结合DUSP2启动子；通过敲低DUSP2或使用ERK抑制剂验证DUSP2-ERK-mTOR轴的因果关系。
RB-R-linker对TRIM24介导的mTOR信号通路的抑制
验证源自RB-S249/T252的RB-R-linker能否竞争性抑制TRIM24功能，从而失活mTOR信号。
过表达GFP-RB-R-linker，检测与TRIM24的结合、对DUSP2表达和ERK/mTOR通路的影响；通过RNA-seq和CUT&Tag分析其调控的转录和基因结合变化。
R-linker-PROTAC的体外和体内抗肿瘤效果
评估R-linker-PROTAC降解TRIM24并抑制前列腺癌的作用。
合成R-linker-PROTAC，用不同浓度处理C4-2和22Rv1细胞，检测TRIM24和下游蛋白水平，以及细胞对RAD001的敏感性；在C4-2异种移植和PDX模型中比较单独或联合RAD001的治疗效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell Life Science & Technology | -- |
| 胎牛血清 | NEWZERUM Ltd | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Biosharp | -- | |
| 药物处理 | PD-0332991（帕博西尼）盐酸盐 | Selleck | -- |
| Temuterkib (LY3214996) | Selleck | -- | |
| 依维莫司（RAD001） | Selleck | -- | |
| VL285 | Selleck | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白提取与定量 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 蛋白质印迹 | PVDF膜 | Millipore | -- |
| ECL检测试剂 | Millipore | -- | |
| ChemiDoc XRS | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 抗体（Western blot） | RB抗体 | Proteintech | 10048-2-Ig |
| TRIM24抗体 | Proteintech | 14208-1-AP | |
| TRIM28抗体 | Proteintech | 15202-1-AP | |
| p-RB (S249/T252)抗体 | Thermo Fisher Scientific | 44-584G | |
| p-S6K1 (Thr389)抗体 | Proteintech | 28735-1-AP | |
| S6K1抗体 | Proteintech | 14485-1-AP | |
| p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| DUSP2抗体 | Proteintech | 27327-1-AP | |
| ERK1/2抗体 | Proteintech | 11257-1-AP | |
| P65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| KLF1抗体 | Abcam | ab175372 | |
| KLF3抗体 | Absin | abs117725 | |
| SP1抗体 | Abcam | ab231778 | |
| p-AKT (S473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| p-AKT (T308)抗体 | Cell Signaling Technology | 13038 | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0037 |
| 染色质免疫沉淀 | 染色质提取试剂盒 | Abcam | ab117152 |
| 一步法磁珠ChIP试剂盒 | Abcam | ab156907 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA定量 | NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录 | Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Accurate Biology | AG11728 |
| 实时荧光定量PCR | Evo M-MLV一步法RT-qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11732 |
| PCR试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| GST pull-down | 谷胱甘肽-琼脂糖珠 | GE Healthcare Lifesciences | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系（C4-2、22Rv1、DU145、PC-3）来源及培养条件（培养基、FBS浓度、抗生素）；siRNA/shRNA序列及转染试剂（Lipofectamine 2000） 阅读提示：Materials and methods - Cell culture, Transient transfection of plasmids |
| 蛋白相互作用分析 | Co-IP和GST pull-down的实验条件（裂解液、抗体用量、洗涤次数）；RB和TRIM24截短突变体及点突变体（如Δ924FQDPV928、S249A/T252A、S249D/T252E） 阅读提示：Materials and methods - Coimmunoprecipitation, GST pull-down assay; 图2图例 |
| 信号通路检测 | 关键蛋白抗体及稀释比例（pS6K1 T389、pERK1/2、TRIM24、DUSP2等）；药物处理浓度和时间（CDK4/6抑制剂PD0332991、ERK抑制剂Temuterkib、mTOR抑制剂RAD001） 阅读提示：Materials and methods - Chemicals and reagents, Western blotting; 图3-5图例 |
| 转录调控分析 | ChIP/CUT&Tag实验的抗体、细胞处理、分析流程；DUSP2启动子区域引物序列 阅读提示：Materials and methods - ChIP, CUT&Tag analysis; 图4、5图例 |
| 体内实验 | 动物模型（BALB/c裸鼠、NSG小鼠）周龄、性别；细胞注射量（5×10^6）；R-linker-PROTAC和RAD001的给药剂量、途径、频率；PDX模型建立方法 阅读提示：Materials and methods - Mouse study; 图6图例 |
| 统计方法 | 统计检验方法（t检验、单因素/双因素方差分析）、显著性阈值（P<0.05）、样本量（n） 阅读提示：Materials and methods - Statistical analysis |