分离与表征新生小鼠肌肉细胞外囊泡
验证NMM-EVs的成功分离及基本特性
从1日龄新生小鼠后肢肌肉培养上清中通过差速超速离心提取NMM-EVs，采用TEM观察形态，NanoFCM分析粒径，Western blot检测表面标志物。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
新生小鼠肌肉细胞外囊泡在骨骼肌修复与再生中的功效
Efficacy of neonatal mouse muscle extracellular vesicles in skeletal muscle repair and regeneration.
实验完整度
高包含体内动物模型、体外细胞实验、分子机制验证等多个证据层级，并进行了功能验证（肌力、CSA）和机制验证（Pax7、miRNA）。
主要模型
新生小鼠（1日龄）骨骼肌来源的细胞外囊泡 C57BL/6小鼠甘油诱导胫骨前肌损伤模型 原代小鼠骨骼肌卫星细胞
重点核对
NMM-EV的分离方法：通过差速超速离心，并在100,000×g离心90分钟沉淀，需验证标志物CD9、CD63、CD81。 动物模型：8周龄雄性C57BL/6小鼠，双侧胫骨前肌注射50%甘油50 μL诱导损伤，EV治疗剂量为每腿250 μg（8.4×10^10颗粒）。 关键时间点：在损伤后第1、4、7、14天收集样本，评估肌肉再生、纤维化、脂肪浸润和功能（握力）。 体外实验：卫星细胞分离自3日龄小鼠，使用5 μg/μl和50 μg/μl的NMM-EV浓度处理，检测增殖、迁移和分化。
摘要
目前，骨骼肌损伤的有效治疗方法仍然有限。骨骼肌的自我修复依赖于卫星细胞（SCs）的激活和分化，这些细胞与受损的肌纤维融合形成新纤维，从而支持肌肉再生。然而，在严重损伤的情况下，肌肉组织很难完全恢复其原始结构和功能，其再生能力通常显著降低。因此，迫切需要开发能够增强肌肉修复和恢复生理功能的疗法。在本研究中，我们研究了来源于新生小鼠骨骼肌的细胞外囊泡（NMM-EVs），其富含来自Pax7⁺肌源性祖细胞的货物。我们假设NMM-EVs能够增强SCs的激活并改善损伤后的肌肉再生。通过使用甘油诱导的胫骨前肌（TA）损伤模型，我们通过组织学、免疫荧光和功能分析评估了肌肉内注射NMM-EVs对骨骼肌再生的影响。在体内，NMM-EVs显著促进骨骼肌再生和功能恢复，上调Pax7表达，增加再生TA的横截面积和肌肉质量，并减少纤维化和脂肪浸润。在体外，NMM-EVs增强了小鼠SCs的增殖和肌源性分化，并在mRNA和蛋白质水平上增加了肌源性调节因子的表达。总之，本研究证明NMM-EVs激活受损肌肉内的SCs，促进其增殖和分化，从而加速损伤修复和肌纤维再生，同时减弱纤维化和脂肪生成重塑。这些发现为开发基于新生肌肉来源的细胞外囊泡、无细胞治疗策略用于骨骼肌损伤提供了科学依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 新生小鼠肌肉来源的细胞外囊泡（NMM-EVs）能否促进骨骼肌损伤后的修复与再生？
- 核心机制
- NMM-EVs通过靶向Pax7激活卫星细胞，促进其增殖和肌源性分化，同时减少纤维化和脂肪浸润。
- 主要证据
- 在甘油诱导的TA损伤模型中，NMM-EVs显著提高Pax7、MyoD、MyoG表达，增加肌纤维横截面积和握力，并减少胶原沉积和脂肪积累；体外实验显示NMM-EVs增强卫星细胞增殖、迁移和分化，并上调myomiRs。
- 研究意义
- 该研究为开发基于新生肌肉来源细胞外囊泡的无细胞治疗策略提供了科学依据，有望用于治疗骨骼肌损伤。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估NMM-EVs在体内对损伤肌肉的修复效果
确定NMM-EVs在体内能否促进肌肉再生和功能恢复
通过甘油注射建立TA肌肉损伤模型，随后两次注射NMM-EVs或PBS，在损伤后第1、4、7、14天进行组织学染色（H&E、Masson、Sirius Red、Oil Red O）和功能测试（握力）。
验证NMM-EVs对卫星细胞激活与增殖的影响
探讨NMM-EVs是否通过激活卫星细胞促进肌肉再生
通过免疫荧光染色和Western blot检测损伤肌肉中Pax7、MyoD、MyoG的表达，并分析单肌纤维中Pax7+细胞数量，评估卫星细胞的激活和增殖。
检测NMM-EVs减少纤维化和脂肪浸润的作用
评估NMM-EVs对损伤后肌肉纤维化和脂肪浸润的影响
通过Oil Red O染色评估脂肪浸润，Masson三色染色和Sirius Red染色评估纤维化，免疫荧光检测Collagen I和α-SMA表达。
体外验证NMM-EVs对卫星细胞增殖、迁移和分化的影响
确认NMM-EVs在体外对卫星细胞功能的影响
分离并培养原代卫星细胞，用NMM-EVs处理，进行CCK-8增殖实验、划痕迁移实验、免疫荧光检测Ki67和肌球蛋白重链（MYHC），以及Western blot和qPCR分析肌源性标志物。
分析NMM-EVs中myomiRs的表达谱
探究NMM-EVs可能的分子机制，特别是通过myomiRs调控卫星细胞
提取NMM-EVs和老化肌肉EVs（Aging-EVs）的总RNA，通过qRT-PCR检测miR-1, miR-206, miR-486, miR-223-3p, miR-140-5p, mmu-miR-501-3p的表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞外囊泡分离 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 细胞外囊泡鉴定 | CD9抗体 | -- | -- |
| CD63抗体 | -- | -- | |
| CD81抗体 | -- | -- | |
| 体内示踪 | PKH67 | -- | -- |
| DiR | -- | -- | |
| 组织学染色 | Masson三色染色 | -- | -- |
| 天狼星红染色 | -- | -- | |
| 油红O染色 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗Pax7抗体 | BIOSS | bs-5080R |
| 抗MyHC抗体 | Sigma | M4276 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Abcam | ab11575 | |
| 抗胚胎肌球蛋白重链抗体 | DSHB | F1.652 | |
| 抗I型胶原抗体 | Abcam | ab34710 | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab7817 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗PAX7抗体 | BIOSS | bs-23668R | |
| 抗MYOD抗体 | BIOSS | bs-1378R | |
| 抗eMyHC抗体 | BIOSS | bs-70370R | |
| 抗MYOG抗体 | BIOSS | bs-1299R | |
| 抗MYHC抗体 | BIOSS | bs-9863R | |
| 抗结蛋白抗体 | BIOSS | bs-1135R | |
| 抗MF-20抗体 | BIOSS | bs-10985R | |
| 抗肌动蛋白抗体 | BIOSS | bs-0061R | |
| 抗微管蛋白抗体 | BIOSS | bs-4513R | |
| qPCR | RNA纯化试剂盒 | Vazyme Biotech | R401-01 |
| PrimeScript™ RT试剂盒（带gDNA Eraser） | Takara | RR037A | |
| 2×SYBR Green qPCR预混液 | Vazyme Biotech | -- | |
| miRNA分析 | miRNeasy® Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| Mir-X™ miRNA第一链合成试剂盒 | Takara | -- | |
| miScript® SYBR® Green PCR试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 血清CK检测 | 肌酸激酶检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| I型胶原酶 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| 细胞染色 | Hoechst 33342 | Sigma | -- |
| DAPI | Sigma | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| 成像系统 | 共聚焦显微镜 | Olympus | FV3000 |
| 小动物活体成像系统 | Jingyi Technology Co., Ltd. | IVIS | |
| 仪器 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| ChemiDoc™ MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄（8周龄雄性C57BL/6）；甘油浓度（50% v/v）、注射体积（50 μL）、注射部位（双侧TA）；麻醉方式及剂量（戊巴比妥钠50 mg/kg）。 阅读提示：Materials and methods, Skeletal muscle injury |
| NMM-EV分离与鉴定 | 新生小鼠日龄（出生24小时内）；培养时间（24 h）；差速离心参数（300×g, 2,000×g, 10,000×g, 100,000×g 90 min）；表征方法（TEM, NanoFCM, Western blot）。 阅读提示：Materials and methods, Isolation of extracellular vesicles from neonatal mouse muscle; Figure 1 |
| NMM-EV给药方案 | 给药剂量（每腿250 μg，8.4×10^10颗粒）；注射体积（50 μL）；注射时间（损伤后连续两天，间隔24小时）；给药途径（肌肉内注射）。 阅读提示：Materials and methods, Extracellular vesicles treatment; Figure 2A |
| 组织学评估 | 切片厚度（8 μm）；染色方法（H&E, Masson's trichrome, Sirius Red, Oil Red O）；图像分析软件（ImageJ）；定量指标（纤维化面积百分比、脂滴面积、肌纤维横截面面积）。 阅读提示：Materials and methods, Histological staining |
| 卫星细胞分离与培养 | 小鼠日龄（3日龄）；酶消化方案（0.1% collagenase type I和0.25% trypsin，37°C 30 min）；筛网（70 μm）；培养基（DMEM + 20% FBS + 1% 青霉素-链霉素）；传代（至第3代）。 阅读提示：Materials and methods, Isolation, culture, and identification of primary satellite cells |
| 体外功能检测 | CCK-8实验细胞密度（1×10^4 cells/well），处理时间（24 h, 48 h），EV浓度（5 μg/μl, 50 μg/μl）；划痕实验细胞密度（3×10^5 cells/well），检测时间（0, 24, 48 h）；分化实验处理时间（5天），分化培养基成分。 阅读提示：Materials and methods, CCK-8 assay, Wound healing assay, Myogenic differentiation assay |