患者和健康供者外周血单细胞转录组分析
描绘AS不同分期（早期活动、晚期功能障碍、临床缓解）与健康对照的PBMC细胞类型和功能变化。
对14例AS患者（EA、LD、RM组）和3例HLA-B27阳性健康供者的PBMC进行scRNA-seq，鉴定18种主要细胞类型，并进行差异基因表达和功能富集分析。
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单免疫细胞转录组学揭示自然杀伤细胞依赖性外源性抗原呈递在强直性脊柱炎严重程度中的作用
Single-immunocyte transcriptomics reveal the role of natural killer cell-dependent exogenous antigen presentation in ankylosing spondylitis severity.
实验完整度
高研究包含scRNA-seq、流式细胞术、qPCR、Western blot、共培养实验、动物模型及组织学验证，涵盖体外、体内及患者样本多个证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
SKG小鼠curdlan诱导的AS模型 外周血单核细胞（PBMC） HLA-DRB1+ NK细胞 CD4+ T细胞
重点核对
AS患者分期标准（EA、LD、RM）及健康供者纳入条件 scRNA-seq细胞捕获数量及测序深度（至少50,000 reads/细胞） NK细胞亚群（APC-NK）鉴定标记（HLA-DRB1） 共培养体系中NK细胞与CD4+ T细胞的比例（1:1或3:1）及时间（48小时） SKG小鼠模型的诱导剂量（3mg curdlan）及NK细胞植入数量（3×10^4）
摘要
强直性脊柱炎（AS）是一种可导致严重畸形的自身免疫性疾病，其发病和进展相关的免疫模式仍知之甚少。在此，我们招募了健康供者和不同分期的患者后，对外周血单核细胞进行了单细胞RNA测序，以研究与AS发病、加重和缓解相关的细胞分类学和免疫学特征，并探索导致AS病变的内在规律。结果显示，大多数细胞类型在疾病发病时固有抗菌防御功能普遍增强，且与AS严重程度呈负相关。被表征为抗原呈递细胞（APC-NK）的自然杀伤（NK）细胞亚群的丰度和外源性抗原呈递评分在疾病加重期间增加，但在缓解期间下降。总体上，APC-NK的丰度和其呈递评分与多种细胞类型的固有防御评分呈负相关。CD4+效应T细胞丰度和细胞毒性，以及HLA-DRB1+ NK细胞（类似于APC-NK）对CD4+ T细胞反应的增强，与AS严重程度相关。将HLA-DRB1+ NK细胞植入经curdlan诱导的SKG模型小鼠中加速了AS样改变；这被CD4+ T细胞耗竭所阻断。NK细胞耗竭改善了AS样小鼠的表型。APC-NK中的HLA-DPB1/DPA1通过介导靶向CD4+ T细胞的抗原呈递参与AS加重。总体而言，固有防御-抗原呈递偶联驱动AS病变和不同结局。此外，固有防御与NK依赖性外源性抗原呈递之间的权衡导致CD4+ T细胞激活或失活，从而促进AS加重或缓解；这揭示了APC-NK是导致强直性畸形的关键因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探索强直性脊柱炎（AS）发病、加重和缓解过程中的免疫学特征，特别是固有防御与外源性抗原呈递之间的平衡如何影响疾病结局。
- 核心机制
- 固有抗菌防御（抗菌肽产生、细菌脂蛋白反应和III型干扰素产生）与NK依赖性外源性抗原呈递（由APC-NK介导）之间的权衡决定CD4+ T细胞的激活或失活，从而驱动AS的加重或缓解；HLA-DPB1/DPA1在APC-NK中通过介导外源性抗原呈递（如OVA127-141）靶向CD4+ T细胞，促进AS加重。
- 主要证据
- scRNA-seq显示APC-NK丰度和外源性抗原呈递评分在AS加重期（LD）升高，缓解期（RM）降低；细胞共培养实验证明HLA-DRB1+ NK细胞增强CD4+ T细胞增殖和细胞毒性；动物实验中，植入HLA-DRB1+ NK细胞加速AS样病变，而CD4+ T或NK细胞耗竭改善表型；HLA-DPB1/DPA1过表达或沉默影响CD4+ T细胞反应。
- 研究意义
- 本研究揭示了APC-NK作为连接固有防御和CD4+ T细胞激活的关键因素，为AS的发病机制提供新见解，并提出靶向HLA-DPA1/DPB1或APC-NK可能作为预防残疾的候选策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NK细胞亚群分析
鉴定与AS严重程度相关的NK细胞亚群及其功能特征。
对NK细胞进行重聚类，得到10个亚群，通过GSVA和功能富集分析评估各亚群功能，并验证APC-NK（HLA-DRB1+）的变化。
APC-NK对CD4+ T细胞功能的影响
验证APC-NK是否通过外源性抗原呈递影响CD4+ T细胞的增殖和细胞毒性。
将HLA-DRB1+ NK细胞与CD4+ T细胞共培养，通过CFSE增殖实验和流式细胞术检测CD4+ T细胞增殖和GZMB表达；使用HLA-DPB1/DPA1过表达或沉默的NK细胞进行共培养。
动物模型验证
在体内验证APC-NK对AS样表型的影响及CD4+ T细胞或NK细胞耗竭的作用。
使用SKG小鼠curdlan诱导AS模型，通过尾静脉注射AAV-DTR和腹腔注射白喉毒素实现细胞耗竭，并植入HLA-DRB1+或HLA-DRB1− NK细胞，观察关节肿胀、影像学和组织学变化。
HLA-DPB1/DPA1在APC-NK中的作用
确定HLA-DPB1/DPA1在APC-NK介导的抗原呈递中的具体作用。
通过慢病毒感染过表达或沉默HLA-DPB1/DPA1，共培养后检测CD4+ T细胞增殖、GZMB表达及OVA127-141的呈递。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞测序 | 单细胞3'文库和凝胶珠试剂盒v3.1 | 10x Genomics | 1000121 |
| Chromium单细胞G芯片试剂盒 | 10x Genomics | 1000120 | |
| 细胞分离 | BD Vacutainer CPT细胞制备管 | BD Biosciences | 362761 |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞控制器 | 10x Genomics | -- |
| 逆转录 | S1000 Touch热循环仪 | Bio-Rad | -- |
| 文库质控 | Agilent 4200 | Agilent | -- |
| 测序 | Illumina Novaseq6000 | Illumina | -- |
| 流式细胞术 | CD3-FITC抗体 | BioLegend | 317306 |
| CD3-PE抗体 | BioLegend | 317308 | |
| GZMB-PerCP抗体 | BioLegend | 396416 | |
| CD8a-PE抗体 | BioLegend | 300908 | |
| KLRF1/NKp80-APC抗体 | BioLegend | 346708 | |
| HLA-DRB1-PE抗体 | BioLegend | 362301 | |
| CD3-PerCP/Cyanine5.5抗体 | BioLegend | 100217 | |
| NK1.1-APC抗体 | BioLegend | 156505 | |
| CD19-FITC抗体 | BioLegend | 363008 | |
| CD56-FITC抗体 | BioLegend | 362546 | |
| GZMB-PE抗体 | BioLegend | 372207 | |
| GZMB-FITC抗体 | BioLegend | 372205 | |
| CD4-PerCP抗体 | BioLegend | 344623 | |
| IFN-γ-PE抗体 | BioLegend | 383403 | |
| KLRK1-PE抗体 | BioLegend | 206303 | |
| HLA-DPB1-PE抗体 | Bioss | bs-4107R | |
| Western blot | GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP |
| HLA-DPB1抗体 | Bioss | bs-4107R | |
| HLA-DPA1抗体 | Bioss | bsm-60290R | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| Omni-ECL增强型Pico光化学发光试剂盒 | Epizyme Biomedical Technology | SQ101 | |
| 全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统 | Tanon | 4600SF | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| CFSE | Elabscience | -- | |
| 共培养 | 卵清蛋白肽 | Solarbio | A8040 |
| 免疫共沉淀 | 抗CD4磁珠免疫沉淀试剂盒 | Sino Biological | MB50134-T52 |
| IP裂解液 | Epizyme | PC105 | |
| 上样缓冲液 | Epizyme | LT101 | |
| Western blot | Flag抗体 | Bioss | bsm-33346M |
| CD4抗体 | Abcam | ab133616 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| LipoBooster 3000转染试剂 | -- | -- | |
| 动物实验 | 可得兰多糖 | Wako Chemicals | -- |
| 白喉毒素 | -- | -- | |
| AAV9载体 | GeneChem | -- | |
| ELISA | IFN-λ1 ELISA试剂盒 | Signalway Antibody | EK41703 |
| IFN-λ2 ELISA试剂盒 | Signalway Antibody | EK3877 | |
| IFN-λ3 ELISA试剂盒 | Signalway Antibody | EK4203 | |
| 组织学 | CD4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19641 |
| HLA-DRB1抗体 | Bioss | bsm-63257R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本收集 | AS患者分期标准：EA、LD、RM分组依据；健康供者HLA-B27状态 阅读提示：Materials and methods: Patient recruitment and clinical characteristics |
| 单细胞RNA测序 | 细胞活力>90%，聚集率<5%；细胞悬液浓度300-600活细胞/μl；测序深度至少50,000 reads/细胞 阅读提示：Materials and methods: Preparation of single-cell suspensions, Cell capture and cDNA synthesis, scRNA-seq library preparation |
| NK细胞亚群鉴定 | NK细胞重聚类参数；HLA-DRB1表达作为APC-NK标记 阅读提示：Materials and methods: Reclustering of T cells and NK cells, Results: NK cell dynamics across AS conditions |
| 共培养实验 | HLA-DRB1+ NK细胞与CD4+ T细胞比例1:1，或HLA-DPB1/DPA1过表达NK细胞比例3:1；培养时间48小时；卵清蛋白浓度20μg/ml；CD4+ T细胞预包被CD3/CD28抗体 阅读提示：Materials and methods: Coculture of CD4+ T cells with corresponding NK cells and subsequent assays |
| 动物实验 | SKG小鼠周龄10周，性别雌性；curdlan剂量3mg；NK细胞植入量3×10^4；AAV注射体积100μl；白喉毒素剂量400ng；诱导时间5或8周 阅读提示：Materials and methods: Induction, treatment and assessment of AS modeling mice |