IP-MS筛选差异结合蛋白
系统性鉴定TMEM43和S358L突变体的差异结合蛋白网络
在A549细胞中表达空载体、HA-Flag-TMEM43或HA-Flag-TMEM43 S358L突变体，通过Flag和HA双标签免疫沉淀纯化复合物，后进行质谱分析。
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TMEM43结合伴侣的蛋白质组学筛选鉴定出VDAC导致线粒体功能障碍
Proteomic screening of TMEM43 binding partners identifies VDAC leading to mitochondrial dysfunction.
实验完整度
中包含IP-MS筛选、IF和TurboID验证结合蛋白、体外细胞功能实验（线粒体形态、膜电位、Ca2+和ROS检测），但缺乏体内动物模型或患者样本的功能验证。
主要模型
A549细胞 H9c2心肌成肌细胞 C57BL/6小鼠心脏
重点核对
IP-MS筛选差异结合蛋白时使用空载体对照 Flag和HA双标签免疫沉淀确保IP特异性 TurboID邻近标记验证蛋白相互作用 线粒体功能检测包括MitoTracker、JC-1、Fluo-4 AM和MitoSOX
摘要
跨膜蛋白43（TMEM43）S358L突变是致心律失常性右心室心肌病（ARVC）严重亚型ARVC5患者中最常见的突变。表征TMEM43突变体的相互作用蛋白对于揭示相关发病机制至关重要。在此，我们应用定量免疫沉淀（IP）-质谱（MS）筛选TMEM43与TMEM43 p.S358L之间的差异结合伴侣，并鉴定了166个相互作用的候选蛋白。这些蛋白的功能富集突出了它们在钙信号传导、脂质代谢和心血管疾病中的参与。免疫荧光（IF）染色和TurboID邻近标记进一步证实了几个选定蛋白的相互作用。此外，我们发现电压依赖性阴离子选择性通道蛋白（VDAC1和VDAC2）与TMEM43突变体的相互作用显著降低。重要的是，在TMEM43 p.S358L的心肌成肌细胞H9c2细胞中，较低的VDAC结合介导了线粒体功能障碍。该研究提供了TMEM43 p.S358L结合蛋白景观的全面视图，并暗示了TMEM43在线粒体中的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TMEM43及其S358L突变体的结合蛋白网络有何差异，以及这些差异如何影响ARVC5的病理机制？
- 核心机制
- TMEM43 S358L突变降低了与VDAC1和VDAC2的结合，导致线粒体功能障碍，包括线粒体碎片化、膜电位丧失、Ca2+水平降低和ROS升高。
- 主要证据
- IP-MS鉴定166个差异结合蛋白；IF和TurboID验证了VDAC1/2与TMEM43的结合；在H9c2细胞中，突变体降低VDAC结合并导致线粒体功能障碍。
- 研究意义
- 该研究提供了TMEM43 p.S358L结合蛋白景观的全面视图，并暗示TMEM43在线粒体中的关键作用，为ARVC5的发病机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异结合蛋白的功能富集分析
解析差异结合蛋白涉及的生物学过程和通路
使用KOBAS 3.0对差异结合蛋白进行GO、KEGG、Reactome、BioCyc、PANTHER等富集分析。
免疫荧光验证蛋白相互作用
验证IP-MS发现的TMEM43及其突变体与选定蛋白的共定位
在A549和H9c2细胞中，对HA-Flag-TMEM43及其S358L突变体与CAV1、ACTG1、APOB、VDAC1/2等进行IF共染色，计算Pearson相关系数和共定位百分比。
TurboID邻近标记验证相互作用
通过邻近标记进一步验证TMEM43及其突变体与结合蛋白的相互作用
将3xHA-Turbo-TMEM43或突变体转染H9c2细胞，进行生物素标记和链霉亲和素下拉或IF共染。
线粒体功能检测
评估TMEM43 S358L突变对线粒体形态和功能的影响
使用MitoTracker Red、JC-1、Fluo-4 AM和MitoSOX分别检测线粒体形态、膜电位、Ca2+水平和ROS水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 慢病毒包装 | pMD2.G | -- | -- |
| psPAX2 | -- | -- | |
| 2x Hank's平衡盐溶液 | -- | -- | |
| 氯化钙 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 |
| Pierce™ BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 | |
| ANTI-FLAG® M2亲和凝胶 | Sigma | A2220 | |
| 3XFlag肽 | Sigma | F3290 | |
| EZview™ Red抗HA亲和凝胶 | Sigma | E6779 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 蛋白质消化 | 二硫苏糖醇 | -- | -- |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 甲酸 | -- | -- | |
| C18柱材料 | Phenomenex | 8B-S100-KEG | |
| 质谱分析 | Q-Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗Flag抗体 | Abmart | -- |
| 抗HA抗体 | Abmart | -- | |
| 抗ACTG1抗体 | Novus Biologicals | -- | |
| 抗CX43抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗EMD抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗Caveolin1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗APOB抗体 | Bioss | -- | |
| 抗LUMA抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗ATP2A2抗体 | Abcam | -- | |
| 抗小鼠Alexa-488二抗 | Invitrogen | -- | |
| 抗兔Alexa-546二抗 | Invitrogen | -- | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 抗TMEM43抗体 | Santa Cruz | -- | |
| 抗VDAC1抗体 | ABclonal | -- | |
| 抗VDAC2抗体 | Proteintech | -- | |
| Zeiss LSM780激光扫描共聚焦系统 | Carl Zeiss MicroImaging | -- | |
| Leica DM6B荧光显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| TurboID质粒构建 | pCDNA3-3xHA-TurboID载体 | Addgene | 107171 |
| 同源克隆试剂盒 | Vazyme | C112 | |
| TurboID邻近标记 | 脂质体转染试剂 | Yeason | 40802ES02 |
| 生物素 | MCE | -- | |
| 兔单克隆抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 兔单克隆抗SERCA2 ATPase抗体 | Abcam | 150435 | |
| 小鼠单克隆抗ApoB抗体 | Biorbyt | orb69428 | |
| 兔单克隆抗Emerin抗体 | Cell Signaling Technology | 30853 | |
| 兔多克隆抗VDAC2抗体 | Proteintech | 116663-1-AP | |
| 兔多克隆抗Caveolin-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3238 | |
| 小鼠单克隆抗Lamin A/C抗体 | Cell Signaling Technology | 4777 | |
| 兔多克隆抗Connexin 43抗体 | Cell Signaling Technology | 3512 | |
| 兔多克隆抗VDAC1抗体 | ABclonal | A15735 | |
| Alexa Fluor 488链霉亲和素 | Yeason | 35103ES60 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)交联Alexa Fluor Plus 594 | Thermo Fisher | A32740 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)交联Alexa Fluor Plus 546 | Thermo Fisher | A-11030 | |
| RIPA裂解缓冲液 | -- | -- | |
| BCA检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| 链霉亲和素磁珠 | MCE | HY-K0208 | |
| 免疫沉淀 | 抗VDAC1抗体 | ABclonal | A15735 |
| 抗VDAC2抗体 | Proteintech | 11663-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Abmart | -- | |
| 抗TMEM43抗体 | Santa Cruz | sc-365298 | |
| 抗VDAC1抗体 | Santa Cruz | sc-390996 | |
| 线粒体染色 | MitoTracker Red CMXRos | Beyotime | C1035 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1 | Beyotime | C2005 |
| Ca2+水平检测 | Fluo4AM | Servicebio | G1724-100T |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX | Life Technologies | M36008 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和培养 | A549和H9c2细胞来源、培养基、血清浓度、培养温度、CO2浓度、病毒感染条件（MOI和时间）及筛选药物浓度 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 慢病毒包装 | 质粒比例、转染试剂、转染时间、病毒收获时间 阅读提示：Methods: Lentivirus packaging |
| IP-MS | 裂解液成分、IP抗体和珠子、洗脱肽浓度、质谱参数、数据处理参数（FDR等） 阅读提示：Methods: Quantitative Immunoprecipitation Mass Spectrometry (IP-MS) analysis |
| 免疫荧光染色 | 细胞密度、固定、通透、封闭、一抗稀释度、二抗稀释度、DAPI浓度、成像系统 阅读提示：Methods: Immunofluorescence (IF) staining |
| TurboID邻近标记 | 质粒构建、细胞密度、转染量、生物素浓度和标记时间、裂解和下拉条件 阅读提示：Methods: TurboID Plasmids and TurboID mediated proximity labeling |
| 线粒体功能检测 | 染料浓度、孵育时间、洗涤步骤、检测方法（荧光显微镜或流式） 阅读提示：Methods: Mitochondria staining, Detection of mitochondrial membrane potential, Detection of Ca2+ level, Measurement of mitochondrial ROS |