A Human Kidney Tubuloid Model of Repeated Cisplatin-Induced Cellular Senescence and Fibrosis for Drug Screening.
包含体外细胞培养、类器官模型、多种分子检测、功能验证（纤维化实验）及RNA-seq分析，多个独立证据层级。
人原代肾近端小管上皮细胞（hRPTEC） 肾小管类器官（Tubuloids） 人肺成纤维细胞（hLFs） 小鼠原代肾成纤维细胞（MPKFs）
顺铂浓度：0.2, 2.0, 20.0 µg mL⁻¹处理类器官 重复处理次数：5次，间隔3次换液和1天培养 纤维化实验：使用条件培养基（CM）处理成纤维细胞48小时 RNA-seq分析：bulk RNA-seq反卷积，参考数据集GSE118184 统计分析：单因素方差分析，p < 0.05
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从患者肾脏组织分离hRPTECs，通过3D培养生成高度分化的肾小管类器官，并验证其近端肾小管特性。
从切除肾脏的皮质组织中分离hRPTECs，用含EGF等生长因子的无血清培养基培养。将细胞接种到超低附着板，添加Matrigel和FBS、EGF、FGF2、HGF，培养1-2周形成类器官。通过免疫染色验证LRP2/Megalin和LTL的表达。提取RNA进行bulk RNA-seq，使用已发表的单细胞RNA-seq数据（GSE118184）进行反卷积分析，确定细胞类型组成。
检测肾小管类器官对顺铂的急性反应，包括DNA损伤、结构破坏、去分化、凋亡和EMT。
分别用0.2, 2.0, 20.0 µg/mL顺铂处理类器官，观察3D结构变化，通过免疫荧光和Western blot检测γH2AX、KIM-1、Cleaved Caspase-3、Vimentin等标志物，并通过流式细胞术定量表达。
模拟慢性肾损伤，通过重复低剂量顺铂处理诱导细胞衰老和SASP。
对类器官进行5次重复顺铂处理（0.2和2.0 µg/mL），每次处理后更换培养基去除药物，并培养1天。之后检测衰老标志物（SA-β-Gal、p16、p21、p53、Lamin B1）、细胞周期分析和炎症细胞因子表达（IL-1β、IL-6）。
验证衰老类器官分泌的因子是否能激活成纤维细胞，促进纤维化。
收集顺铂处理类器官的条件培养基（CM），将其应用于hLFs和MPKFs，通过免疫荧光检测αSMA和胶原I型表达，并通过胶原凝胶收缩实验和迁移实验评估功能效应。对照组包括未处理CM和直接顺铂处理。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Nacalai Tesque | -- |
| Advanced RPMI 1640培养基 | Thermo-Fisher Scientific | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| II型胶原酶 | Worthington Biochemical | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Nacalai Tesque | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo-Fisher Scientific | -- | |
| 氢化可的松 | Thermo-Fisher Scientific | -- | |
| ITS液体培养基补充剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 人重组表皮生长因子 | Thermo-Fisher Scientific | -- | |
| 成纤维细胞生长因子2 | -- | -- | |
| 肝细胞生长因子 | -- | -- | |
| RNA-seq | Sepasol-RNA I Super G试剂 | Nacalai Tesque | -- |
| Direct-zol RNA小提Plus试剂盒 | Zymo Research | R2070 | |
| SMART-Seq mRNA HT LP试剂盒 | Takara Bio | Z4792N | |
| Illumina NovaSeq X Plus系统 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | ProLong Glass防淬灭封片剂（含NucBlue） | Thermo-Fisher Scientific | -- |
| Western blot | WesternBlue显色试剂 | Promega | -- |
| 流式细胞术 | FxCycle紫染料 | Thermo-Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | Thermal Cycler Dice实时荧光定量PCR仪Lite TP700 | Takara Bio | -- |
| TB绿预混Ex Taq II | Takara Bio | -- | |
| ReverTra Ace逆转录酶 | TOYOBO | -- | |
| 纤维化生物测定 | CytoSelect 24孔细胞收缩实验试剂盒 | Cell Biolabs | -- |
| 细胞迁移 | CytoSelect 24孔细胞迁移实验试剂盒 | Cell Biolabs | -- |
| FilterMax F5酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 免疫荧光 | Eclipse Ti2显微镜 | Nikon | -- |
| 流式细胞术 | BD FACSLyric流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 免疫荧光 | 生物素化的LTL | Vector Labs | B-1325-2 |
| Alexa Fluor 633链霉亲和素 | Thermo-Fisher | S21375 | |
| Western blot | 兔抗ERK2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S |
| 免疫荧光/流式 | 兔抗LRP2/Megalin抗体 | Abcam | ab236244 |
| 免疫荧光 | 兔抗γH2AX抗体 | Cell Signaling Technology | #9718 |
| 小鼠抗Na+/K+-ATPase抗体 | Sigma-Aldrich | 05-369 | |
| 山羊抗KIM-1抗体 | R&D systems | AF1750 | |
| 兔抗caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | #9664 | |
| 兔抗Vimentin抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| 兔抗p16-INK4A多克隆抗体 | Proteintech | 10883-1-AP | |
| 兔抗IL-1β多克隆抗体 | Bioss | bs-0812R | |
| Cy3偶联兔抗αSMA抗体 | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| 兔抗I型胶原抗体 | Rockland | 600-406-103 | |
| Western blot | 小鼠抗p21抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6247 |
| 兔抗Lamin B1多克隆抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 兔抗p53多克隆抗体 | Proteintech | 10442-1-AP | |
| 兔抗KIM-1抗体 | Thermo-Fisher Scientific | PA5-20244 | |
| 兔抗Vimentin抗体 | Cell Signaling Technology | #5741 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Nacalai Tesque | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肾小管类器官生成 | hRPTECs分离和培养条件：胶原酶消化浓度、培养基组成（生长因子）、基质胶用量。 阅读提示：Methods: Human Renal Tubuloid Culture和Cell Culture Experiment |
| 顺铂处理（急性） | 顺铂浓度（0.2, 2.0, 20.0 µg/mL）、处理时间和频次。 阅读提示：Results 2.2 和 Figure 2 图注 |
| 重复顺铂处理（衰老） | 重复次数（5次）、每次处理后的换液和培养时间（3次换液，1天）、顺铂浓度（0.2和2.0 µg/mL）。 阅读提示：Methods: 未明确，但可从Figure 3A实验设计推断 |
| 纤维化生物测定 | CM制备步骤（处理48h后换无血清DMEM，孵育48h）、成纤维细胞类型和密度、CM处理时间。 阅读提示：Methods: Fibrosis Bioassay |
