小鼠感染模型建立与表型分析
建立PCV2感染的小鼠模型，观察病毒复制和脾脏病理变化。
BALB/c小鼠腹腔注射PCV2或PBS，检测血清和器官病毒载量，进行脾脏组织学观察。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PCV2感染通过抑制生发中心亮区B细胞与辅助细胞的相互作用来抑制其分化
PCV2 Infection Represses the Differentiation of Light Zone Germinal Center B Cells by Inhibiting Their Interaction with Helper Cells.
实验完整度
高研究包含scRNA-seq、流式细胞术、RT-qPCR、Western blot及小鼠模型，涵盖体外和体内验证，且包含功能验证与机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠PCV2感染模型 小鼠脾脏B细胞
重点核对
PCV2感染剂量：105 TCID50/500 μL，腹腔注射 感染时间：28天 对照组：PBS注射 样本量：每组3只小鼠（流式和测序） 检测指标：B细胞亚群比例、功能基因表达、细胞间相互作用
摘要
猪圆环病毒2型（PCV2）是猪群中最常见的免疫抑制病毒之一，损害猪群疫苗的保护效力。先前的研究表明，PCV2感染会降低宿主疫苗接种所诱导的免疫记忆和抗体分泌。在本研究中，我们利用小鼠脾脏细胞的单细胞mRNA测序表明，PCV2感染减慢了生发中心（GC）亮区B细胞向记忆B细胞和浆细胞的分化。我们发现，尽管PCV2感染导致小鼠脾脏淋巴细胞耗竭，但剩余的脾脏B细胞被感染激活。PCV2感染小鼠中初始B细胞的百分比下降主要是由于分化而非死亡。同时，记忆B细胞和浆细胞的百分比增加，但功能基因表达没有显著增强。聚焦于GC B细胞，我们发现PCV2感染激活了暗区GC B细胞的增殖，但未激活亮区GC B细胞的分化。此外，PCV2感染未显著改变Prdm1的转录水平，而Bach2的水平则显著降低。进一步分析显示，在PCV2感染小鼠的脾脏中，亮区GC B细胞与树突状细胞、巨噬细胞和滤泡辅助T细胞之间的相互作用减弱。总之，本研究发现PCV2感染损害了B细胞向功能性记忆B细胞和浆细胞的分化。这可能是PCV2感染损害疫苗效率的一个重要且以前未被认识的原因。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PCV2感染如何影响B细胞分化及功能，从而损害疫苗诱导的体液免疫？
- 核心机制
- PCV2感染减弱了亮区生发中心B细胞与树突状细胞、巨噬细胞和滤泡辅助T细胞的相互作用，抑制了Bach2表达，阻碍了B细胞向记忆B细胞和浆细胞的分化。
- 主要证据
- scRNA-seq和流式细胞术显示，PCV2感染导致暗区GC B细胞增殖增加，但亮区GC B细胞分化受阻，Bach2表达降低，与辅助细胞的相互作用减弱。
- 研究意义
- 研究揭示了PCV2感染损害疫苗效率的新机制，为理解PCV2诱导的体液免疫抑制和疫苗研发提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析
鉴定脾脏细胞类型和B细胞亚群，比较PCV2感染组和对照组的细胞组成变化。
取脾脏制备单细胞悬液，进行10x Genomics scRNA-seq，使用Seurat进行聚类和注释。
流式细胞术验证B细胞亚群比例
验证PCV2感染对B细胞亚群比例的影响。
脾脏淋巴细胞染色，检测初始B细胞、GC B细胞、记忆B细胞、浆细胞及GC B细胞亚群。
功能基因表达检测
评估PCV2感染对B细胞功能基因表达的影响。
流式分选初始B细胞、GC B细胞、LZ GC B细胞，提取RNA或蛋白，进行RT-qPCR和Western blot。
细胞间相互作用分析
分析PCV2感染对B细胞与辅助细胞间信号交流的影响。
使用CellChat分析scRNA-seq数据推断细胞间配体-受体相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | ExCell | FSP500 | |
| 病毒检测 | 病毒RNA/DNA提取试剂盒Ver.5.0 | Takara | 9766 |
| qPCR | 通用SYBR Green快速qPCR预混液 | ABclonal | RK21203 |
| 单细胞悬液制备 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| 木瓜蛋白酶 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| 死细胞去除磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium单细胞3'试剂盒（V3） | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- | |
| 细胞分离 | 小鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒 | Solarbio | P8860 |
| 流式细胞术 | 染色缓冲液 | Biolegend | 420201 |
| PE/Cyanine7抗B220抗体 | Biolegend | 103222 | |
| PE抗CD138抗体 | Biolegend | 142503 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗CD38抗体 | Biolegend | 102721 | |
| APC抗GL7抗体 | Biolegend | 144617 | |
| FITC抗CD86抗体 | Biolegend | 105109 | |
| APC/Cyanine7抗CXCR4抗体 | Biolegend | 146523 | |
| FITC抗Ki67抗体 | Biolegend | 151211 | |
| APC抗IgD抗体 | Elabscience | E-AB-F1189E | |
| FITC抗IgM抗体 | Elabscience | E-AB-F1190C | |
| FITC抗IgG抗体 | Biolegend | 406001 | |
| 抗ZNF318抗体 | Biorbyt | orb1088967 | |
| APC抗兔IgG抗体 | R&D Systems | F0111 | |
| 固定液 | Bioss | CO3-02001 | |
| 胞内染色透化洗涤缓冲液 | Biolegend | B205349 | |
| RT-qPCR | 无RNA酶DNA酶 | Roche | 4716728001 |
| HiScript RT SuperMix qPCR反转录预混液 | Vazyme | R323-01 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白上样缓冲液 | Beyotime | PP117-01 | |
| 抗MHC II类抗体 | abcam | ab139365 | |
| 抗MYC抗体 | abcam | ab195207 | |
| 抗AICDA抗体 | Immunoway | YT5566 | |
| 抗BACH2抗体 | Immunoway | YN16971 | |
| HRP抗大鼠IgG H&L抗体 | abcam | ab205720 | |
| HRP抗兔IgG H&L抗体 | Thermo Fisher | 31460 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒制备与感染 | PCV2毒株（GenBank MH492006），感染剂量105 TCID50/500 μL腹腔注射，对照组PBS 500 μL，感染周期28天 阅读提示：材料与方法：病毒、细胞和动物；小鼠实验；图1A |
| 单细胞测序 | 小鼠脾脏单细胞悬液制备，细胞活力（对照组93.4%，PCV2组94.4%），细胞浓度（1060 cells/μL对照，1070 cells/μL PCV2），捕获细胞数（9665对照，6477 PCV2），测序平台和深度（NovaSeq 6000，20,000 reads/cell） 阅读提示：材料与方法：组织解离与单细胞悬液制备；Chromium 10x Genomics文库和测序 |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号及荧光标记（如B220, CD138, CD38, GL7, CD86, CXCR4），染色条件（室温避光30分钟），细胞分选和检测仪器（BD FACSAria III, Agilent NovoCyte），数据分析软件（De Novo） 阅读提示：材料与方法：流式细胞术检测和分离细胞；表1及正文 |
| RT-qPCR | 引物序列（表S2），内参基因Gapdh，反应条件（预变性95°C 3min；95°C 5s，60°C 30s，45循环） 阅读提示：材料与方法：定量RT-PCR；表S2 |
| Western blot | 裂解液（RIPA含PMSF），上样缓冲液，抗体信息（见表），封闭条件（5% BSA，2小时），一抗孵育（4°C过夜），二抗孵育（室温2小时） 阅读提示：材料与方法：Western blotting |