鉴定候选基因
通过生物信息学分析筛选AAA中与VSMCs相关的关键基因。
整合6个批量RNA-seq数据集（GSE47472等），使用ComBat校正批次效应，采用limma和Rank-In方法鉴定差异表达基因，并通过SVM-RFE和LASSO回归筛选候选基因。
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PDGF-BB/EGR1轴驱动成纤维细胞活化蛋白表达促进腹主动脉瘤
PDGF-BB/EGR1 Axis Drives Fibroblast Activation Protein Expression to Promote Abdominal Aortic Aneurysm.
实验完整度
高包含人类样本、小鼠模型及体外细胞实验，涵盖转录组分析、功能验证（FAP抑制）和机制验证（EGR1结合FAP启动子）。
主要模型
MOVAS小鼠血管平滑肌细胞系 PPE诱导的C57BL/6小鼠AAA模型 人AAA组织样本 感染性AAA患者（单例）
重点核对
细胞处理：PDGF-BB浓度（0、10、20 ng/ml）和时间（24小时） EGR1 siRNA转染序列及转染后48小时检测 小鼠模型：PPE处理10分钟，FAP抑制剂Ac-Gly-BoroPro剂量10 mg/kg每日腹腔注射，术后14天取材 AAA定义：腹主动脉直径较对照组增加≥50% 统计学：P值<0.05，双尾检验，使用GraphPad Prism 9.0
摘要
本研究探讨了成纤维细胞活化蛋白（FAP）在腹主动脉瘤（AAA）发展过程中血管平滑肌细胞（VSMCs）中的分子机制。批量RNA测序和单细胞RNA测序分析揭示，AAA来源的VSMCs中FAP表达升高。在猪胰弹性蛋白酶（PPE）诱导的AAA小鼠模型中，FAP的药理学抑制（Ac-Gly-BoroPro）减弱了动脉瘤形成并减少了巨噬细胞浸润。进一步分析表明，PDGF-BB通过转录因子EGR1上调VSMCs中的FAP表达，EGR1与FAP启动子结合以驱动转录。EGR1抑制显著降低了PDGF-BB诱导的FAP表达，凸显了其调控作用。此外，在一例感染性AAA患者的临床18F-FAP抑制剂PET/CT成像中，动脉瘤壁显示出强烈的FAP表达。这些发现强调了PDGF-BB/EGR1/FAP轴在AAA发病机制中的重要性，并提示靶向FAP可能为控制AAA进展提供治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FAP在AAA中的表达模式及其在VSMCs中的调控机制和功能是什么？
- 核心机制
- PDGF-BB通过上调转录因子EGR1，EGR1直接结合FAP启动子，从而转录激活FAP表达。
- 主要证据
- 基于批量RNA-seq和单细胞RNA-seq数据及RT-qPCR、IHC、IF验证FAP在AAA中高表达；在PPE诱导的AAA小鼠模型中，FAP抑制剂（Ac-Gly-BoroPro）显著减小动脉瘤尺寸并减少巨噬细胞浸润；体外实验显示PDGF-BB剂量依赖性上调FAP蛋白水平，EGR1 siRNA阻断该效应；ChIP-qPCR证实EGR1结合FAP启动子。
- 研究意义
- 靶向FAP可能为调节炎症和阻止AAA进展提供有前景的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序分析
验证候选基因在AAA中的细胞类型特异性表达模式。
整合三个scRNA-seq数据集（GSE166676, GSE237230, GSE226492）进行批次校正和聚类，识别细胞群体，分析FAP表达。
人样本验证
验证候选基因在AAA患者组织中的表达。
收集AAA患者及正常主动脉组织，通过RT-qPCR、IHC和IF分析FAP表达及与VSMCs的共定位。
FAP与巨噬细胞浸润关联分析
探究FAP表达与AAA中巨噬细胞浸润的相关性。
基于FAP表达将AAA样本分为高/低组，使用CIBERSORT评估免疫细胞比例；IHC检测CD68阳性细胞并分析相关性。
小鼠AAA模型验证
在PPE诱导的AAA小鼠模型中评估FAP抑制对动脉瘤形成的影响。
对C57BL/6小鼠进行PPE处理诱导AAA，并给予FAP抑制剂Ac-Gly-BoroPro或生理盐水，测量主动脉直径并进行组织学分析。
体外机制研究
阐明PDGF-BB调控FAP表达的分子机制。
用PDGF-BB处理VSMCs，通过Western blot检测FAP表达；敲低EGR1后检测对FAP诱导的影响；ChIP-qPCR验证EGR1与FAP启动子的结合。
临床PET/CT成像
评估FAPi PET/CT在感染性AAA中的成像价值。
对一例感染性AAA患者进行18F-FAPi-42和18F-FDG PET/CT成像，分析摄取，并取术后组织进行IHC染色验证FAP表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
转录组数据分析
机器学习筛选
免疫浸润分析
染色质分析
影像学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 重组小鼠PDGF-BB | Medchemexpress | HY-P7087 |
| Western blot | FAP抗体 | Bioss | bs-5758R |
| FAP抗体 | abcam | ab207178 | |
| EGR1抗体 | Cell Signaling Technology | 4154 | |
| ACTA2抗体 | Proteintech | 67735 | |
| 免疫组织化学 | F4/80抗体 | Proteintech | 28463 |
| CD68抗体 | Cell Signaling Technology | 76437 | |
| Western blot | GAPDH抗体 | Proteintech | 60004 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| 细胞转染 | Lipo3000转染试剂 | ThermoFisher | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green荧光染料 | Accurate Biology | AG11701 |
| 动物实验 | Ac-Gly-BoroPro | -- | -- |
| ChIP-qPCR | ChIP-IT高灵敏度试剂盒 | Active Motif | 53040 |
| 抗EGR1抗体 | -- | P2078 | |
| EVG染色 | 弹性纤维Van Gieson染色 | -- | -- |
| PET/CT成像 | 18F-FAPi-42 | -- | -- |
| 18F-氟代脱氧葡萄糖 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | MOVAS细胞培养条件（DMEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素），PDGF-BB浓度（0,10,20 ng/ml）和处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: VSMCs culture and treatment |
| 基因敲低实验 | EGR1 siRNA序列、转染试剂（Lipo3000）、转染后检测时间（48小时） 阅读提示：Methods: siRNA transfection |
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6）、性别（雄性）、年龄（8-9周）、PPE处理时间（10分钟）、FAPi剂量（10 mg/kg）及给药方式（腹腔注射）、取材时间（14天） 阅读提示：Methods: Animal studies; 图5图例 |
| 蛋白质检测 | Western blot抗体信息（FAP、EGR1、GAPDH等）及稀释比例 阅读提示：Methods: Materials and Western blot |
| 基因表达检测 | RT-qPCR引物序列（见表1）、内参基因（GAPDH） 阅读提示：Methods: RNA isolation and RT-qPCR; Table 1 |
| 染色质免疫沉淀 | ChIP-qPCR试剂盒（ChIP-IT High Sensitivity Kit）、交联时间（15分钟）、抗体（anti-EGR1和IgG）、引物序列 阅读提示：Methods: ChIP-qPCR analysis |
| 组织学分析 | 切片厚度（3-4 µm用于HE/EVG，5 µm用于IHC/IF）、染色方法（HE、EVG、IHC、IF） 阅读提示：Methods: Histological examination |
| PET/CT成像 | 示踪剂（18F-FAPi-42、18F-FDG）、两次扫描间隔（至少24小时）、图像重建算法（RAMLA） 阅读提示：Methods: PET imaging procedure and evaluation |