单细胞转录组测序及细胞类型鉴定
比较年轻和年老小鼠视网膜的转录谱，鉴定不同细胞类型及其比例变化。
从3只年轻和3只年老小鼠视网膜制备单细胞悬液，利用10x Genomics平台进行scRNA-seq，通过UMAP聚类鉴定10种视网膜细胞类型。
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单细胞RNA测序揭示衰老相关的小胶质细胞胞葬作用损伤导致视网膜损伤后凋亡细胞积累
Single-Cell RNA-Seq Reveals Aging-Related Impairment of Microglial Efferocytosis Contributing to Apoptotic Cells Accumulation After Retinal Injury.
实验完整度
高包含scRNA-seq、体外DOX诱导衰老BV2细胞实验、体内I/R损伤小鼠模型及免疫荧光和Western blot验证，多种独立证据层级。
主要模型
年轻（2-3月龄）和年老（16-18月龄）C57BL/6小鼠视网膜 BV2小鼠小胶质细胞系 R28大鼠视网膜细胞系 661W小鼠视网膜光感受器细胞系 HUVEC人脐静脉内皮细胞 rMC-1大鼠视网膜Müller细胞
重点核对
scRNA-seq分析中年轻和年老小鼠各3只。 BV2细胞使用200 nM DOX处理24小时诱导衰老。 体外胞葬实验使用H2O2诱导凋亡的视网膜细胞与BV2共培养，比例为1:1。 视网膜I/R损伤模型通过升高眼压至110 mmHg持续1小时建立。 Western blot检测MerTK和Axl蛋白表达，使用β-actin作为内参。
摘要
衰老与视网膜细胞凋亡增加相关，这导致视网膜功能下降。凋亡视网膜细胞的清除依赖于小胶质细胞的胞葬作用，但衰老对这一过程的影响尚未完全阐明。在本研究中，我们旨在通过单细胞RNA测序（sc‐RNA‐seq）比较年轻和年老小鼠视网膜转录谱来阐明这一问题，其中来自年轻和年老小鼠的74,412个视网膜细胞被分类为10种转录上不同的视网膜细胞类型，并且年轻与年老视网膜之间的差异表达基因主要与细胞衰老和凋亡相关。此外，与年轻视网膜相比，年老视网膜中小胶质细胞与其他视网膜细胞之间的配体-受体相互作用（如AXL‐GAS6、MERTK‐GAS6）增强。此外，在小胶质细胞中，部分聚类发现亚簇4与胞葬作用相关，其中年老小胶质细胞的胞葬作用相关基因下调。衰老对小胶质细胞胞葬作用的影响在体外通过阿霉素（DOX）诱导衰老的BV2小胶质细胞得到进一步验证，并在体内通过视网膜缺血/再灌注（I/R）损伤小鼠模型得到验证。体外，DOX处理的BV2小胶质细胞的胞葬作用以及胞葬作用相关的MerTK和Axl蛋白表达显著降低；这在年老视网膜I/R损伤后也存在，表现为离子化钙结合适配器分子1阳性小胶质细胞与凋亡视网膜细胞的共定位增加，同时胞葬作用相关蛋白表达减少。总体而言，小胶质细胞对凋亡细胞的胞葬作用随衰老而下降，提示调节这一过程可能作为年龄相关性视网膜疾病的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老是否影响视网膜小胶质细胞的胞葬作用，从而导致凋亡细胞积累？
- 核心机制
- 衰老导致小胶质细胞中胞葬作用相关受体MerTK和Axl表达下调，进而损害其对凋亡视网膜细胞的清除能力，并伴有NF-κB信号通路上调及炎症因子产生增加。
- 主要证据
- scRNA-seq分析发现年老小胶质细胞亚簇4中胞葬作用相关基因下调；体外DOX诱导衰老的BV2细胞胞葬作用降低，MerTK和Axl表达下降；体内I/R损伤模型中，年老视网膜TUNEL阳性细胞增加，小胶质细胞胞葬作用降低，MerTK和Axl表达减少。
- 研究意义
- 调节小胶质细胞胞葬作用可能成为年龄相关性视网膜疾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异表达基因及通路富集分析
鉴定年轻和年老视网膜细胞间的差异表达基因，并分析富集的生物学通路。
使用Seurat FindMarkers识别各细胞类型中年老与年轻的DEGs，并进行GO/KEGG富集分析和GSEA。
细胞间通讯分析
评估衰老对小胶质细胞与其他视网膜细胞之间配体-受体相互作用的影响。
使用CellPhoneDB和CellChat分析小胶质细胞与其他细胞类型的通讯，特别是胞葬相关配体受体（CX3CR1-CX3CL1, AXL-GAS6, MERTK-GAS6）。
小胶质细胞亚群分析
识别与胞葬作用相关的小胶质细胞亚群，并比较年轻和年老间的差异。
对小胶质细胞进行部分聚类分析，得到5个亚簇，通过KEGG和GO富集分析，结合标记基因识别亚簇4与胞葬作用相关。
体外验证DOX诱导衰老BV2细胞胞葬功能
验证衰老对小胶质细胞胞葬作用的影响。
用200nM DOX处理BV2细胞诱导衰老，通过SA-β-gal染色和Western blot确认衰老。将BV2与凋亡视网膜细胞共培养，检测胞葬效率及MerTK、Axl表达。
体内验证I/R损伤模型中衰老对胞葬作用的影响
在体内模型中验证衰老是否导致小胶质细胞胞葬功能受损。
建立小鼠视网膜I/R损伤模型，通过免疫荧光检测TUNEL阳性细胞、Iba-1+TUNEL+共定位、Iba-1+MerTK+细胞，Western blot检测Bax、Bcl-2、Gas6、MerTK、Axl蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
通路富集分析
细胞间通讯分析
动物模型
统计分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞制备 | 胶原酶IV | -- | -- |
| 木瓜蛋白酶 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 红细胞裂解液 | MACS | 130-094-183 | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| scRNA-seq建库 | 10x Genomics Chromium 单细胞3'试剂盒（V3） | 10x Genomics | -- |
| scRNA-seq测序 | Illumina NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Meilunbio | -- |
| 低糖DMEM培养基 | Cytiva | -- | |
| 高糖基础DMEM培养基 | GIBCO | -- | |
| DMEM/F-12培养基 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞衰老诱导 | 阿霉素 | -- | -- |
| 凋亡诱导 | 过氧化氢 | -- | -- |
| 凋亡检测 | 碘化丙啶 | Beyotime | C2015M |
| Hoechst 33342 | Beyotime | C1027 | |
| 体外胞葬实验 | Vybrant CFDA细胞示踪试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 组织包埋 | OCT包埋剂 | Sakura Finetek | -- |
| 免疫荧光染色 | Triton X-100 | -- | -- |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| 抗Iba-1抗体 | Abcam | ab283319 | |
| FITC标记的山羊抗小鼠二抗 | ZSGB-BIO | ZF-0312 | |
| 抗Gas6抗体 | Proteintech | 13,795-1-AP | |
| 抗MerTK抗体 | Abcam | ab300136 | |
| 抗Axl抗体 | Bioss | bs-5180R | |
| TRITC标记的山羊抗兔二抗 | ZSGB-BIO | ZF-0316 | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Dako | S3023 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | Epizyme | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 抗CX3CL1抗体 | Proteintech | 60339-1-Ig | |
| 抗CX3CR1抗体 | Abcam | ab308613 | |
| 抗Bax抗体 | Zen-Bioscience | R22708 | |
| 抗Bcl-2抗体 | ZEN BIO | R23309 | |
| 抗P53抗体 | Proteintech | 10442-1-AP | |
| 抗P16抗体 | ZEN BIO | R23896 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| ECL检测试剂 | -- | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Leica | -- |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物来源及伦理 | 小鼠品系C57BL/6，年轻组2-3月龄，年老组16-18月龄，雌雄未说明 阅读提示：Materials and Methods 2.1 |
| 单细胞悬液制备 | 酶消化条件：0.35% collagenase IV, 2 mg/mL papain, 120 U/mL DNase I, 37°C 20 min 阅读提示：Materials and Methods 2.1 |
| scRNA-seq建库和测序 | 使用10x Genomics Chromium Single-Cell 3' Kit (V3)，测序平台Illumina NovaSeq 6000，最小深度20,000 reads/cell 阅读提示：Materials and Methods 2.2 |
| scRNA-seq数据分析 | 质控标准：线粒体基因比例>25%或基因数<500的细胞剔除；Seurat聚类分辨率0.8；DEG标准：q≤0.01, |log2FC|≥0.26, 检测细胞比例>10% 阅读提示：Materials and Methods 2.3, 2.4 |
| 细胞培养条件 | BV2细胞培养基RPMI 1640+10%FBS+1%P/S；其他细胞类型培养基不同，均需10%FBS和1%P/S，37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and Methods 2.8 |
| DOX诱导衰老 | BV2细胞80%融合度时，200 nM DOX处理24小时，PBS洗两次，再培养8小时 阅读提示：Materials and Methods 2.9 |
| 体外胞葬实验 | BV2与凋亡视网膜细胞共培养比例1:1，过夜；凋亡诱导用H2O2 50mM处理10分钟（R28）或5分钟（PI染色） 阅读提示：Materials and Methods 2.10, 2.11 |
| 视网膜I/R损伤模型 | 32G针连接生理盐水瓶插入前房，升高至1.5m，使眼压110 mmHg，持续1小时，然后撤针再灌注 阅读提示：Materials and Methods 2.12 |
| 原位胞葬作用检测 | TUNEL染色试剂盒来自Roche，Iba-1抗体1:100，二抗FITC 1:200 阅读提示：Materials and Methods 2.13 |
| Western blot | 蛋白上样量20 μg，抗体稀释比例已列出，ECL检测 阅读提示：Materials and Methods 2.15 |
| 统计方法 | 两组比较采用非配对双尾Student's t-test，p<0.05为显著 阅读提示：Materials and Methods 2.16 |