鉴定LINC01811在结直肠癌中的差异表达
筛选在结直肠癌组织和癌旁组织中差异表达的lncRNA，并验证LINC01811的差异表达。
利用TCGA数据库456例CRC组织和41例癌旁组织的RNA-Seq数据进行差异表达分析，结合GENECode注释提取lncRNA表达值；通过edgeR包筛选差异表达lncRNA；在15对临床CRC组织及癌旁组织中进行RT-qPCR验证LINC01811表达。
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长链非编码RNA LINC01811吸附miR-214-3p并上调YAP1从而促进结直肠癌的迁移和侵袭。
Long noncoding RNA LINC01811 sponges miR-214-3p and upregulates YAP1 thereby promoting the migration and invasion of colorectal cancer.
实验完整度
中包含TCGA数据挖掘、临床样本RT-qPCR验证、细胞系体外功能实验（Transwell、Western blot）及双荧光素酶报告实验，但缺乏动物模型和体内验证。
主要模型
结直肠癌细胞系HT29 结直肠癌细胞系（HT29、HCT15、LOVO、Caco-2） 正常结肠上皮细胞系NCM460 结直肠癌患者组织样本
重点核对
细胞系：HT29（用于功能实验） 转染试剂：Lipo8000™转染试剂 Transwell实验中基质胶的使用及孵育时间（8小时） 双荧光素酶报告实验中pmirGLO载体构建 内参基因：U6和β-actin
摘要
长链非编码RNA（lncRNAs）对癌症的发展有显著影响。然而，它们在结直肠癌（CRC）中的作用尚未完全阐明。通过差异表达分析确定了CRC样本中LINC01811的表达水平，并通过RT-qPCR实验进行了验证。采用Transwell实验研究LINC01811在CRC中的生物学功能。为了阐明LINC01811作为miR-214-3p的分子海绵并调控YAP1表达的机制，采用了结合位点分析、荧光素酶报告实验、RT-qPCR和Western blotting。我们在CRC组织和细胞系中鉴定了一个新的致癌lncRNA LINC01811。结果表明，抑制LINC01811可通过调节上皮间质转化相关标志物（包括MMP2、MMP9、vimentin和E-cadherin）在体外显著降低CRC细胞的侵袭和迁移。此外，LINC01811通过隔离miR-214-3p调控YAP1表达，从而通过抑制其活性促进CRC进展。总之，本研究确定了一个新的lncRNA LINC01811通过miR-214-3p/YAP1轴参与CRC进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 长链非编码RNA LINC01811在结直肠癌进展中的表达、功能及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- LINC01811通过吸附miR-214-3p，解除miR-214-3p对其靶基因YAP1的抑制作用，从而上调YAP1表达，促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。
- 主要证据
- 基于TCGA和临床样本分析证实LINC01811在结直肠癌中高表达；体外敲低LINC01811降低细胞迁移和侵袭，并改变EMT标志物表达；双荧光素酶报告实验验证LINC01811与miR-214-3p结合及miR-214-3p对YAP1的调控；功能回复实验显示miR-214-3p抑制剂或YAP1过表达可逆转LINC01811敲低的效果。
- 研究意义
- 本研究揭示LINC01811/miR-214-3p/YAP1轴在结直肠癌进展中的关键作用，提示LINC01811可能作为结直肠癌的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LINC01811敲低对CRC细胞迁移和侵袭的影响
评估沉默LINC01811对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。
在HT29细胞中转染si-LINC01811，使用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，并通过Western blot检测EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9）的表达。
验证LINC01811与miR-214-3p的靶向结合
验证LINC01811是否作为miR-214-3p的分子海绵，并确认其靶向关系。
通过starBase预测结合位点；构建含miR-214-3p结合位点或突变位点的pmirGLO载体（LINC01811-WT/MUT），与miR-214-3p mimics共转染HT29细胞，进行双荧光素酶报告实验；同时检测LINC01811敲低后miR-214-3p的表达变化。
验证miR-214-3p对YAP1的靶向调控
验证miR-214-3p是否直接靶向YAP1，并调控其表达。
利用starBase预测结合位点；构建含miR-214-3p结合位点的YAP1 3'-UTR野生型（YAP1-WT）和突变型（YAP1-MUT）荧光素酶报告载体，与miR-214-3p mimics或抑制剂共转染HT29细胞，进行双荧光素酶报告实验；通过Western blot和RT-qPCR检测过表达或抑制miR-214-3p后YAP1的表达变化。
功能回复实验验证LINC01811/miR-214-3p/YAP1轴的调控作用
验证LINC01811对CRC细胞迁移、侵袭和EMT的影响是否通过miR-214-3p/YAP1轴介导。
在HT29细胞中进行回复实验：分别转染si-LINC01811#3联合miR-214-3p inhibitor或si-LINC01811#3联合YAP1过表达载体（OE-YAP1），检测细胞迁移、侵袭能力及EMT相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 25200-072 | |
| 青霉素-链霉素混合液 | Gibco | MP 1670249-M | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-072 | |
| 细胞转染 | Lipo8000™转染试剂 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | TRNzol通用试剂 | Tiangen | DP424 |
| 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | P1020 | |
| 逆转录和RT-qPCR | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | PCR仪（Veriti） | Thermo Fisher | -- |
| miRNA RT-qPCR | miRcute plus miRNA第一链cDNA试剂盒 | Tiangen | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Solarbio | R002 |
| PMSF蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| Western blot - 一抗 | 抗E-cadherin抗体 | CST | 3195T |
| 抗Vimentin抗体 | CST | 5741T | |
| 抗MMP9抗体 | CST | 13667T | |
| 抗MMP2抗体 | Proteintech | 66366-1-Ig | |
| 抗YAP1抗体 | Proteintech | 66900-1-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Untibody | UM4002 | |
| Western blot - 二抗 | 山羊抗兔IgG-HRP | Bioss | bs-0295G-HRP |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Bioss | bs-0296G-HRP | |
| Western blot - 显影 | ECL化学发光试剂 | Beyotime | P0018S |
| Tanon5200全自动化学发光图像分析系统 | Tanon | -- | |
| 细胞迁移和侵袭 | Transwell小室 | Costar | 3422 |
| 基质胶 | BD | 356234 | |
| 细胞迁移和侵袭 - 染色 | 结晶紫溶液 | Wuhan Google Biotechnology Co., Ltd. | G1014 |
| 细胞迁移和侵袭 - 拍照 | 荧光倒置显微镜 | OLYMPUS | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | pmirGLO报告载体 | Youbio | -- |
| siRNA和miRNA转染 | 靶向LINC01811的小干扰RNA | Ribobio | -- |
| 阴性对照小干扰RNA | Ribobio | -- | |
| miR-214-3p抑制剂 | Ribobio | -- | |
| miR-214-3p抑制剂阴性对照 | Ribobio | -- | |
| miR-214-3p模拟物 | Ribobio | -- | |
| miR-214-3p模拟物阴性对照 | Ribobio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系：HT29、HCT15、LOVO、Caco-2、NCM460；培养基：DMEM+10%FBS；转染试剂：Lipo8000™ 阅读提示：Methods小节：Cell culture and transfection |
| RNA提取和RT-qPCR | 总RNA提取试剂：TRNzol；逆转录试剂盒：RevertAid；PCR仪：Veriti；内参：U6和β-actin；定量方法：2^-ΔΔCt 阅读提示：Methods小节：RNA extract and RT-qPCR assay；Table 1 |
| 蛋白质印迹 | 裂解液：RIPA；定量：BCA；一抗稀释比例：1:1000（CST）或1:1000（Proteintech），内参GAPDH 1:2000；二抗1:3000 阅读提示：Methods小节：Western blotting assay |
| 细胞迁移和侵袭 | Transwell小室型号：Costar 3422；上室包被Matrigel或不包被；下室含20%血清；孵育时间：8小时；固定与染色：甲醇固定，2%结晶紫染色 阅读提示：Methods小节：Cell invasion and migration |
| 双荧光素酶报告实验 | 报告载体：pmirGLO；共转染：miR-214-3p mimics或NC；结合位点预测：starBase；突变构建 阅读提示：Methods小节：Dual-luciferase reporter assay |