验证HKDC1在OC细胞中的表达
评估HKDC1在卵巢癌细胞系中的表达水平，筛选后续实验细胞模型。
通过qRT-PCR和WB检测正常卵巢上皮细胞IOSE80和OC细胞系（HEY, SKOV3, ES2, OVCAR3）中HKDC1 mRNA和蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HKDC1通过稳定G6PC/G6PC2促进卵巢癌进展，增强脂质代谢和免疫逃逸
HKDC1 promotes ovarian cancer progression through boosting lipid metabolism and immune escape by stabilizing G6PC/G6PC2.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、脂质代谢检测、免疫细胞共培养、机制验证（Co-IP、IF、CHX、MG132）及体内小鼠模型验证，多个独立证据层级。
主要模型
SKOV3细胞系 HEY细胞系 ID8细胞系 C57BL/6J小鼠上皮性卵巢癌模型
重点核对
SKOV3和HEY细胞中HKDC1敲低/过表达效率 FFA处理浓度（150 μM）和时间（24小时） G6PC/G6PC2过表达或敲低对HKDC1功能的回复效应 体内实验中sh-HKDC1、sh-HKDC1+oe-G6PC、sh-HKDC1+oe-G6PC2分组及肿瘤生长评估 PBMCs共培养中免疫细胞亚群和功能分子的流式分析
摘要
卵巢癌（OC）是一个重大的健康挑战，但其进展机制仍不清楚。本研究探讨了含己糖激酶结构域蛋白1（HKDC1）在OC中的作用，重点关注肿瘤生长、脂质代谢和免疫逃逸。使用人OC细胞系（SKOV3和HEY）和小鼠OC细胞系（ID8）来敲低和过表达HKDC1。建立了基于ID8的上皮性OC小鼠模型以验证体外发现。我们的结果表明，HKDC1在OC中上调，并促进细胞增殖、迁移和侵袭。HKDC1通过升高游离脂肪酸（FFA）、甘油三酯、磷脂、胆固醇和中性脂质水平，同时上调关键酶（ACC1、FASN、SCD1、HMGCS1和HMGCR），从而增强脂质积累。它通过上调PD-L1促进免疫逃逸，抑制T细胞增殖，降低IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素水平，同时增加PD-1水平。HKDC1敲低逆转了这些效应，而添加FFA则可恢复这些效应。机制上，HKDC1与葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基（G6PC/G6PC2）相互作用并使其稳定，支持其促肿瘤功能。这些发现在OC小鼠模型中得到证实，强调HKDC1通过脂质生物合成和免疫抑制是OC进展的关键驱动因素，提供了潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HKDC1在卵巢癌进展中的具体作用及其是否通过调节脂质代谢和免疫逃逸影响肿瘤发展。
- 核心机制
- HKDC1通过与G6PC/G6PC2相互作用并稳定其蛋白，上调脂质合成相关酶（ACC1、FASN、SCD1、HMGCS1、HMGCR）和PD-L1表达，促进脂质积累和免疫逃逸，从而推动肿瘤进展。
- 主要证据
- 体外实验显示HKDC1敲低抑制细胞增殖、迁移、侵袭和脂质积累，过表达则相反；FFA或G6PC/G6PC2过表达可回复敲低效应。Co-IP和IF证实HKDC1与G6PC/G6PC2结合和共定位。体内小鼠模型验证了HKDC1敲低抑制肿瘤生长和增加免疫细胞浸润，而G6PC/G6PC2过表达逆转这些效应。
- 研究意义
- 研究揭示了HKDC1通过稳定G6PC/G6PC2促进卵巢癌进展的分子机制，提示HKDC1是卵巢癌治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能验证HKDC1对OC细胞增殖、迁移、侵袭和脂质代谢的影响
在体外确定HKDC1对卵巢癌细胞恶性表型和脂质代谢的调控作用。
在SKOV3细胞中敲低HKDC1，在HEY细胞中过表达HKDC1，通过CCK-8、集落形成、划痕愈合、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭；通过生化试剂盒和BODIPY染色检测脂质水平；通过qRT-PCR和WB检测脂质代谢相关酶表达。
体外验证HKDC1对免疫逃逸的影响
探讨HKDC1是否通过调节免疫细胞功能促进卵巢癌细胞免疫逃逸。
将PBMCs与HKDC1敲低的SKOV3或过表达的HEY细胞共培养，通过流式细胞术检测T细胞、NK细胞、Treg细胞比例及PD-1、IFN-γ、GZMB、perforin表达。
验证FFA对HKDC1敲低效应的回复作用
确定HKDC1对细胞功能和免疫逃逸的影响是否通过脂质代谢介导。
在SKOV3和ID8细胞中敲低HKDC1并添加150 μM FFA处理，检测细胞增殖、迁移、侵袭、脂质水平和免疫共培养中的免疫细胞变化。
验证HKDC1与G6PC/G6PC2的相互作用及对蛋白稳定性的影响
揭示HKDC1调节G6PC/G6PC2的分子机制。
通过Co-IP验证HKDC1与G6PC/G6PC2相互作用；通过WB检测HKDC1敲低或过表达对G6PC/G6PC2蛋白表达的影响；使用MG132和CHX处理评估蛋白稳定性；通过IF检测共定位。
验证G6PC/G6PC2在HKDC1功能中的必要性
确认G6PC/G6PC2是HKDC1促进OC进展的关键下游效应分子。
在HKDC1敲低的SKOV3/ID8细胞中过表达G6PC或G6PC2，在HKDC1过表达的HEY细胞中敲低G6PC/G6PC2，检测细胞增殖、迁移、侵袭、脂质代谢和免疫逃逸相关指标。
体内验证HKDC1促进肿瘤生长和免疫逃逸
在体内动物模型中验证HKDC1通过G6PC/G6PC2促进肿瘤生长和免疫逃逸的作用。
建立ID8细胞皮下移植瘤模型，分为sh-NC、sh-HKDC1、sh-HKDC1+oe-G6PC、sh-HKDC1+oe-G6PC2四组，监测肿瘤生长，28天后分析肿瘤组织、血清脂质水平和免疫细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Abiowell | AW-MC002 |
| DMEM培养基 | Abiowell | AW-M003 | |
| McCoy's 5A培养基 | Abiowell | AW-M007 | |
| RPMI-1640培养基 | Procell | CM-0079 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| PBMC分离 | Ficoll-Hypaque密度梯度离心液 | -- | -- |
| 抗CD3抗体 | eBioscience | 12-0038-42 | |
| FlowComp免疫磁珠 | Invitrogen | 11365D | |
| 抗CD28抗体 | eBioscience | 46-0037-42 | |
| 流式分析 | 抗CD45抗体 | eBioscience | 25-0451-82 |
| 抗CD4抗体 | eBioscience | MA5-17451 | |
| 抗CD8抗体 | eBioscience | 17-0088-42 | |
| 抗CD16抗体 | eBioscience | 17-0168-42 | |
| 抗CD56抗体 | eBioscience | 11-0566-42 | |
| 抗CD25抗体 | eBioscience | 17-0257-42 | |
| 抗FOXP3抗体 | eBioscience | 53-4776-42 | |
| 抗PD-L1抗体 | eBioscience | 17-5983-42 | |
| 抗IFN-γ抗体 | eBioscience | 17-7311-82 | |
| 胰蛋白酶消化液 | Abiowell | AWC0232 | |
| 红细胞裂解液 | Beyotime | C3702 | |
| 抗IFN-γ抗体 | eBioscience | 25-7311-41 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | NU679 |
| 酶标仪 | Heleas | MB-530 | |
| 细胞侵袭实验 | Matrigel基质胶 | Corning | 356234 |
| 倒置显微镜 | Cnmicro | DSZ2000X | |
| 生化分析 | 颗粒酶B ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E08718h |
| 穿孔素ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E09313h | |
| 游离脂肪酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A042-2-1 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A110-1-1 | |
| 胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A111-1-1 | |
| 磷脂检测试剂盒 | Jianglai Bio | JL-T2427 | |
| 中性脂质染色 | BODIPY 493/503染料 | Invitrogen | D3922 |
| 共聚焦显微镜 | Olympus | FV-1000 | |
| qRT-PCR | TRIzol总RNA提取试剂盒 | Invitrogen | 15596026 |
| NanoDrop ND-1000紫外分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| mRNA逆转录试剂盒 | CWBIO | CW2569 | |
| Ultra SYBR混合物 | CWBIO | CW2601 | |
| QuantStudio 1荧光PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Abiowell | AWB0136 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Biosharp | BL521A | |
| 抗HKDC1抗体 | Abcam | ab209846 | |
| 抗PD-L1抗体 | Abiowell | AWA58022 | |
| 抗G6PC抗体 | Proteintech | 22169-1-AP | |
| 抗G6PC2抗体 | Abiowell | AWA55928 | |
| 抗G6PC3抗体 | Abcam | ab133964 | |
| 抗ACC1抗体 | Proteintech | 67373-1-Ig | |
| 抗FASN抗体 | Abiowell | AWA45912 | |
| 抗SCD1抗体 | Abiowell | AWA55851 | |
| 抗HMGCS1抗体 | Abiowell | AWA47308 | |
| 抗HMGCR抗体 | Abiowell | AWA42482 | |
| 抗CD36抗体 | Proteintech | 18836-1-AP | |
| 抗CPT1A抗体 | Abiowell | AWA46060 | |
| 抗β-actin抗体 | Abiowell | AWA80002 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| Co-IP | 对照兔IgG抗体 | Proteintech | B900610 |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | -- | -- | |
| 药物处理 | MG132蛋白酶体抑制剂 | -- | -- |
| 棕榈酸 | Sigma-Aldrich | 39756-30-4 | |
| 油酸 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 动物实验 | Matrigel®基质胶 | Corning | -- |
| 免疫荧光 | 三重标记免疫荧光试剂盒 | Abiowell | AWI0693a |
| 抗HKDC1抗体 | Proteintech | 25874-1-AP | |
| 抗G6PC抗体 | ABclonal | A20193 | |
| 抗G6PC2抗体 | Invitrogen | 720253 | |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab217344 | |
| 抗PD-L1抗体 | Proteintech | 17952-1-AP | |
| 抗GZMB抗体 | Abcam | ab255598 | |
| 抗穿孔素抗体 | Bioss | bs-7128R | |
| 荧光显微镜 | Motic | BA410T | |
| 免疫组化 | 抗CD3抗体 | Proteintech | 17617-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基类型 阅读提示：Methods and materials - Cell culture |
| 细胞转染 | siRNA和过表达质粒序列、转染试剂及浓度、转染时间 阅读提示：Methods and materials - Cell transfection |
| FFA处理 | PA和OA溶解方法、BSA浓度、FFA工作液浓度（150 μM）和处理时间（24小时） 阅读提示：Methods and materials - FFA preparation |
| PBMC共培养 | PBMCs分离方法、T细胞纯化步骤、共培养细胞密度（OC细胞2×10^5, PBMCs 6×10^5）和时间（16小时） 阅读提示：Methods and materials - Purification of T cells, Cell co-culture |
| 体外功能实验 | CCK-8实验细胞密度（1×10^4）和孵育时间（48h+4h），集落形成细胞密度（200 cells/well）和培养时间（2-3周），划痕实验细胞密度（5×10^5）和观察时间，Transwell侵袭实验细胞密度（1×10^5）和Matrigel浓度（1:8稀释）及时间（24小时） 阅读提示：Methods and materials - CCK-8, Colony formation, Wound healing, Cell invasion |
| 生化分析 | GZMB、perforin、FFA、TG、CHO、PL检测试剂盒及操作步骤 阅读提示：Methods and materials - Biochemical analysis |
| 中性脂质染色 | BODIPY 493/503浓度（1 μg/mL）和孵育时间（1小时） 阅读提示：Methods and materials - Neutral lipid fluorescent staining |
| Western blot | 抗体种类、稀释比例、孵育时间、封闭条件、曝光时间 阅读提示：Methods and materials - Western blot, Table 2 |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、体重、分组、细胞注射量（7×10^6）、注射体积（150 μL）、肿瘤体积计算公式、28天观察时间、安乐死方法 阅读提示：Methods and materials - Animal experiments |