验证健脾清热通络方通过LncRNA HOTAIR/APN/PI3K/AKT减轻骨关节炎炎症和血脂异常

Validation of Jianpi Qingre Tongluo Recipe in Reducing Inflammation and Dyslipidemia in Osteoarthritis via Lnc RNA HOTAIR/APN/PI3K/AKT.

作者信息Xiaolu Chen, Jian Liu, Guizhen Wang, Yanqiu Sun, Xiang Ding, Xianheng Zhang
PMID39081673
发布时间2024-07-26
DOI10.2147/IJGM.S466148

实验完整度

包含临床数据挖掘、网络药理学、分子对接和体外细胞实验,具有多个证据层级,但缺乏动物实验验证。

主要模型

OA患者外周血单核细胞(PBMC)与软骨细胞(OA-CH)共培养模型 SD大鼠含药血清制备模型

重点核对

JQP给药方案:XFC 3粒/次,3次/天;HQC 3粒/次,3次/天,持续1个月(临床部分) JQP含药血清制备:SD大鼠灌胃JQP 2.592 g/kg,连续7天,血清添加浓度为20% PBMC刺激浓度筛选:CCK-8法确定最佳刺激浓度(具体浓度文中未明确) HOTAIR转染:pcDNA3.1-LncRNA HOTAIR或si-LncRNA HOTAIR质粒,Lipofectamine 2000转染,孵育24小时

摘要

目的:健脾清热通络方(JQP)已广泛应用于临床,其抗骨关节炎(OA)的有效性和具体机制备受关注。本研究旨在探讨JQP治疗OA的临床效果及其减轻炎症和血脂异常的分子机制。方法:通过数据挖掘评估JQP治疗OA的临床疗效。通过网络药理学技术,构建“活性成分-靶点-疾病”相互作用网络,分析相关蛋白的相互作用关系,并进行基因通路生物学过程富集分析。使用PyMOL和AutodockTools-1.5.7进行分子对接。最后,通过细胞实验验证JQP延缓OA免疫炎症的作用。结果:我们发现JQP可以改善免疫炎症和脂质代谢指标;降低OA患者的VAS和SAS评分。JQP的靶基因与OA的靶基因共有98个重叠基因。TNF、IL-6、IL-1β和AKT1在所有靶基因中共享最高的中心性。KEGG分析揭示,在抗OA系统中,98个交集基因主要富集在PI3K/AKT通路。在体外,外周血单核细胞(PBMC)刺激后,骨关节炎软骨细胞(OA-CH)中炎症细胞因子失衡,脂联素(APN)表达降低。此外,含JQP血清通过下调HOTAIR水平,从而上调APN并抑制PI3K/AKT通路,保护OA-CH。结论:本研究提示JQP可能通过调节HOTAIR/APN/PI3K/AKT减轻OA炎症并改善脂质代谢。我们的结果为OA提供了新的解决方案。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
JQP是否通过调节HOTAIR/APN/PI3K/AKT通路减轻OA的炎症和血脂异常?
核心机制
JQP通过下调HOTAIR,上调APN,抑制PI3K/AKT通路,平衡炎症因子,从而减轻免疫炎症和改善脂质代谢。
主要证据
临床数据挖掘显示JQP改善患者炎症和血脂指标;网络药理学预测PI3K/AKT通路;体外细胞实验证实JQP含药血清下调HOTAIR、上调APN、抑制PI3K/AKT磷酸化,并减少促炎因子(IL-1β、IL-6)、增加抗炎因子(IL-4、IL-10)。
研究意义
研究为JQP治疗OA提供了临床和实验依据,并揭示其潜在分子机制,为OA治疗提供了新思路。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床疗效评估

评估JQP对OA患者临床症状和实验室指标的影响

招募OA患者和健康对照,JQP治疗1个月,检测ESR、hs-CRP、TC、TG等指标,评估VAS、SAS、SDS评分,并进行关联规则分析。

2

网络药理学分析

预测JQP治疗OA的潜在靶点和通路

通过TCMSP筛选JQP活性成分,收集药物和疾病靶点,构建化合物-靶点网络、PPI网络,进行GO和KEGG富集分析。

3

分子对接

验证核心靶点与JQP活性成分的结合活性

使用AutoDock Vina进行分子对接,计算结合能,可视化最优对接结果。

4

细胞共培养模型建立

模拟OA炎症微环境,验证PBMCs对软骨细胞的影响

将OA患者PBMCs与OA软骨细胞共培养,检测HOTAIR表达及炎症因子和APN水平。

5

HOTAIR功能验证

验证HOTAIR对软骨细胞活力、炎症因子和APN/PI3K/AKT通路的影响

通过过表达或敲低HOTAIR,检测细胞活力、炎症因子水平、APN表达及PI3K/AKT磷酸化。

6

机制验证

验证APN和PI3K/AKT通路在HOTAIR调控中的作用

使用PI3K/AKT抑制剂或过表达APN,检测HOTAIR对细胞活力、炎症因子和通路蛋白的影响。

7

JQP含药血清干预

验证JQP含药血清对共培养细胞的保护作用及机制

JQP含药血清干预共培养细胞,检测HOTAIR表达、炎症因子水平、APN及PI3K/AKT通路变化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基HycloneSH30022.01
胎牛血清BI04-001-1ACS
胰酶BeyotimeC0205
青霉素----
链霉素----
Lipofectamine 2000转染试剂----
Trizol试剂----
PrimeScript RT试剂盒(含gDNA Eraser)TaKaRaRR047A
Novostart SYBR qPCR SuperMix PlusnovoproteinE096-01B
IL-6 ELISA试剂盒Wuhan Genmei TechnologyJYM0140Hu
IL-1β ELISA试剂盒Wuhan Genmei TechnologyJYM0083Hu
IL-10 ELISA试剂盒Wuhan Genmei TechnologyJYM0155Hu
IL-4 ELISA试剂盒Wuhan Genmei TechnologyJYM0142Hu
APN ELISA试剂盒Wuhan Genmei TechnologyJYM1859Hu
酶标仪RaytoRT-6000
CCK-8检测试剂盒BIOSSBA00208
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒Beyotime--
电泳仪TanonEPS300
电泳槽TanonVE-180
转膜仪TanonVE-186
荧光显微镜----
自动曝光仪Shanghai Peiqing TechnologyJS-1070P
p-AKT抗体CST4060s
PI3K抗体Abcamab86714
PTEN抗体Abcamab170941
AKT抗体CST4691s
p-PI3K抗体Abcamab182651
APN抗体biossbs-0471R
ADIPOR1抗体biossbs-0610R
ADIPOR2抗体biossbs-0611R
GAPDH抗体ZsbioTA-08
山羊抗小鼠IgGZsbioZB-2305
山羊抗兔IgGZsbioZB-2301
山羊抗兔IgG (FITC)----
中药系统药理学数据库与分析平台----
健脾清热通络方----
Transwell小室NEST701001

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
临床研究
患者纳入标准、JQP给药方案、观察指标及检测方法
阅读提示:Materials and Methods: Clinical Research
网络药理学
活性成分筛选条件(OB≥30%,DL≥0.18)、数据库来源、富集分析参数
阅读提示:Materials and Methods: Network Pharmacology and Molecular Docking
分子对接
软件版本、参数设置、结合能阈值
阅读提示:Materials and Methods: Molecular Docking
细胞共培养
PBMCs提取方法、共培养比例、刺激浓度、培养条件
阅读提示:Materials and Methods: Cell Experiment
HOTAIR转染
质粒种类、转染试剂、孵育时间、转染效率验证
阅读提示:Materials and Methods: Co-Culture of PBMCs with CHs from OA Patients and Transfection
JQP含药血清制备
动物品系、周龄、体重、给药剂量、给药时间、血清制备步骤
阅读提示:Materials and Methods: Administration Method of JQP and Preparation of JQP-Medicated Serum