小鼠模型建立与验证
生成肝细胞特异性RIPK1缺陷小鼠并验证敲除效率。
将Ripk1flox/flox小鼠与Albumin-Cre转基因小鼠杂交获得Ripk1-hepKO小鼠，并通过Western blot检测肝组织中RIPK1表达确认敲除。
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肝细胞RIPK1在代谢挑战期间维持肝脏稳态中的作用
Role of hepatocyte RIPK1 in maintaining liver homeostasis during metabolic challenges.
实验完整度
高包含肝细胞特异性敲除小鼠、AAV介导的敲除、RIPK1激酶死亡小鼠、转录组和单细胞测序等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
肝细胞特异性RIPK1敲除小鼠（Ripk1-hepKO） RIPK1激酶死亡小鼠（Ripk1-K45A） AAV8-TBG-Cre介导的肝细胞RIPK1敲除小鼠 AML12肝细胞系（Ripk1-/-）
重点核对
禁食时间：12小时（20:00至8:00） 4-PBA剂量和给药方式：80 mg/kg腹腔注射 HFD喂养时间：6天 小鼠周龄：6周龄 样本量：每组6只（n=6）
摘要
作为代谢的中枢，肝脏在进化过程中表现出强大的适应性，以应对食物波动维持稳态。然而，调控这种适应性的机制尚未完全阐明。在本研究中，我们发现肝细胞中的受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）是代谢挑战（如短期禁食或高脂饮食）期间维持肝脏稳态的关键调节因子。我们的结果表明，肝细胞特异性缺失RIPK1使肝脏对短期禁食诱导的肝损伤和肝细胞凋亡敏感，这在雄性和雌性小鼠中均观察到。尽管短期禁食是通常不诱导肝脏炎症的常见生理应激源，但在肝细胞特异性RIPK1缺陷（Ripk1-hepKO）小鼠中，短期禁食触发了肝脏炎症和代偿性增殖。转录组分析显示，短期禁食使Ripk1-hepKO小鼠的肝脏微环境趋向炎症状态，炎症和免疫细胞募集相关基因表达上调。单细胞RNA测序进一步证实了Ripk1-hepKO小鼠禁食期间肝脏细胞组成的改变，突出显示巨噬细胞向肝脏的募集增加。机制上，我们的结果表明内质网应激参与了Ripk1-hepKO小鼠禁食诱导的肝损伤。总之，我们的发现揭示了RIPK1在代谢波动期间维持肝脏稳态中的作用，并阐明了细胞死亡、炎症和代谢之间的复杂相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝细胞RIPK1在代谢挑战（如短期禁食和高脂饮食）期间是否及如何维持肝脏稳态？
- 核心机制
- 肝细胞RIPK1的支架功能通过抑制细胞凋亡和炎症来维持肝脏稳态，其缺失导致内质网应激介导的肝损伤和炎症反应。
- 主要证据
- Ripk1-hepKO小鼠在短期禁食后出现血清ALT/AST升高、肝细胞凋亡和炎症，而Ripk1-K45A小鼠无此现象；转录组和单细胞测序显示炎症和巨噬细胞募集增加；ER应激抑制剂4-PBA可缓解这些表型。
- 研究意义
- 揭示了RIPK1在维持肝脏稳态中的新生理作用，可能有助于根据Ripk1基因多态性或表达谱为特定人群定制间歇性禁食或热量限制方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
短期禁食模型诱导
观察短期禁食对Ripk1-hepKO小鼠肝脏的影响。
6周龄小鼠从20:00开始禁食12小时，禁食结束后采集血清和肝脏组织，检测肝损伤、凋亡和代谢指标。
肝损伤与细胞死亡检测
确定禁食诱导的肝损伤是否由凋亡或坏死性凋亡引起。
检测血清ALT/AST水平，TUNEL染色和cleaved caspase-3免疫荧光评估凋亡，phospho-MLKL免疫荧光评估坏死性凋亡。
炎症和代偿性增殖评估
评估禁食是否诱导Ripk1-hepKO小鼠肝脏炎症和代偿性增殖。
通过RT-qPCR检测炎症因子（Ccl2, Tnfa, Ifng, Il6）和增殖标志物（Afp, Mki67）表达，免疫组化检测MKI67阳性细胞，流式细胞术量化MKI67阳性细胞。
转录组分析
表征禁食诱导的肝脏转录组变化和炎症相关通路。
对肝脏组织进行bulk RNA-seq，鉴定差异表达基因，进行KEGG通路富集和聚类分析。
单细胞转录组分析
揭示禁食后肝脏细胞组成变化和细胞间通讯。
从禁食小鼠肝脏分离非实质细胞进行scRNA-seq，聚类分析细胞类型，亚聚类巨噬细胞，并使用CellChat分析细胞间配体-受体相互作用。
ER应激在禁食诱导肝损伤中的作用验证
确定ER应激是否参与禁食诱导的肝损伤和炎症。
检测ER应激标志物（CHOP, BIP, IRE1a, p-IRE1a）表达，并使用ER应激抑制剂4-PBA预处理小鼠，评估对肝损伤和炎症的拯救效果。
AAV介导的肝细胞特异性敲除验证
使用另一种策略确认肝细胞特异性RIPK1缺失的效果。
通过尾静脉注射AAV8-TBG-Cre病毒到Ripk1-Con小鼠，4周后进行禁食实验，评估肝损伤、凋亡、炎症和ER应激。
短期高脂饮食模型验证
评估其他代谢挑战是否也诱导类似表型。
Ripk1-Con和Ripk1-hepKO小鼠分别喂食高脂饮食（HFD）或正常饮食（ND）6天，检测肝损伤、凋亡、炎症和ER应激标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 血清和肝脏生化检测 | 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 |
| 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| 总胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| 游离脂肪酸含量检测试剂盒 | Solarbio | BC0595 | |
| 酮体检测试剂盒 | Abcam | ab272541 | |
| 甘油三酯含量检测试剂盒 | Solarbio | BC0625 | |
| 凋亡检测 | TUNEL亮红凋亡检测试剂盒 | Vazyme | A113-02 |
| 流式细胞术 | 固定/破膜缓冲液套装 | ABclonal | RK50005 |
| Western blot | 抗Caspase-3抗体（兔多克隆） | Cell Signaling Technology | 9662S |
| 抗MLKL抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 37705S | |
| 免疫荧光和Western blot | 抗裂解Caspase-3抗体（兔多克隆） | Cell Signaling Technology | 9661S |
| 抗磷酸化MLKL (S345)抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 37333S | |
| 免疫荧光 | 抗F4/80抗体（兔多克隆） | Servicebio | GB113373 |
| 抗CD11b抗体（兔多克隆） | Servicebio | GB11058 | |
| 抗CCR2抗体（兔多克隆） | Servicebio | GB11326 | |
| 抗CX3CR1抗体（兔多克隆） | Servicebio | GB11861 | |
| 免疫组织化学 | 抗MKI67抗体（兔单克隆） | Bioss | bs-2130R |
| 免疫荧光 | 抗ALB抗体（小鼠单克隆） | Servicebio | GB122080 |
| 免疫荧光和Western blot | 抗TNF-α抗体（小鼠单克隆） | proteintech | 60291-1-Ig |
| Western blot | 抗RIPK1抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 3493S |
| 抗磷酸化IRE1α (S724)抗体（兔多克隆） | Abcam | ab48187 | |
| 抗IRE1α抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 3294S | |
| 抗BIP抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 3177S | |
| 抗CHOP抗体（小鼠单克隆） | Cell Signaling Technology | 2895S | |
| 流式细胞术 | 抗CD11b-ABflo 647抗体（兔单克隆） | ABclonal | A24095 |
| 抗F4/80-PE抗体（兔单克隆） | ABclonal | A25659 | |
| 抗Ki67-ABflo 488抗体（兔单克隆） | ABclonal | A26239 | |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体（小鼠单克隆） | Servicebio | GB12001 |
| 抗GAPDH抗体（小鼠单克隆） | Servicebio | GB12002 | |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| qPCR | Hieff qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen Biotech | -- |
| iQ5实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | P1005 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1081 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen | -- | |
| PVDF膜 | Millipore Corporation | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | CLiNX | -- | |
| scRNA-seq | 10× Chromium控制器 | 10× Genomics | -- |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 10× Chromium单细胞3'文库 | 10× Genomics | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000 S2测序系统 | Illumina | -- | |
| 红细胞裂解液（10×） | Miltenyi Biotec | -- | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| RNA-seq | TruSeq链特异性总RNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| FASTING模型 | 4-苯基丁酸 | Sigma | SML0309 |
| AAV实验 | AAV-TBG-Cre病毒 | Obio Technology | H5721 |
| AAV-TBG-null病毒 | Obio Technology | H20594 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 基因型：Ripk1flox/flox (Ripk1-Con)和Albumin-cre转基因小鼠；背景：C57BL/6J；周龄：6周；性别：雌雄均用。 阅读提示：Materials and methods - Mouse models |
| 禁食模型 | 禁食时间：12小时；开始时间：20:00；期间可饮水；禁食结束后采集血清和肝脏组织。 阅读提示：Materials and methods - Mouse models; Figure 1 legend |
| ER应激抑制实验 | 4-PBA剂量：80 mg/kg；给药方式：腹腔注射；时间点：8:00和22:00；禁食从20:00开始，持续12小时。 阅读提示：Materials and methods - Mouse models; Figure 5 legend |
| 高脂饮食模型 | HFD (TP201482)或ND (LAD 0011)喂养6天；最后一天禁食3小时（7:00开始）。 阅读提示：Materials and methods - Mouse models; Figure 7 legend |
| AAV介导敲除实验 | AAV8-TBG-Cre或AAV8-TBG-null病毒剂量：1.5×10^11基因拷贝/只；注射方式：静脉注射；注射后4周进行禁食实验。 阅读提示：Materials and methods - Mouse models; Figure 6 legend |
| scRNA-seq | 600 mg肝脏组织；细胞活力>90%；上机浓度1000细胞/μl；使用10× Genomics平台。 阅读提示：Materials and methods - Single-cell RNA sequencing |