验证FcRn对PRRSV感染的影响
检测FcRn是否参与PRRSV感染及具体作用。
通过shRNA敲低PAMs中FCGRT，感染PRRSV-2株FJ、SH和PRRSV-1株SH2022，检测病毒蛋白表达和病毒滴度；过表达猪或猴FCGRT于MARC-145细胞，感染PRRSV FJ后检测病毒蛋白和滴度。
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新生儿Fc受体是猪繁殖与呼吸综合征病毒脱壳所必需的
The neonatal Fc receptor (FcRn) is required for porcine reproductive and respiratory syndrome virus uncoating.
实验完整度
高包含细胞模型（PAMs、MARC-145、HEK-293T）的基因敲降、过表达、抗体/IgG阻断、CRISPR/Cas9敲除、回补实验，以及吸附、内化、免疫共沉淀、免疫荧光等验证，证据层级多且功能验证充分。
主要模型
猪肺泡巨噬细胞（PAMs） MARC-145细胞 HEK-293T细胞（用于拯救实验）
重点核对
FCGRT敲低后PRRSV感染的抑制作用（Western blot和TCID50） FcRn抗体和IgG阻断PRRSV感染（浓度依赖性） FCGRT、B2M、CD163单基因敲除MARC-145细胞对PRRSV感染的抗性 回补FcRn恢复PRRSV增殖（不同物种FCGRT） FcRn与PRRSV N和M蛋白在早期内体中的相互作用（Co-IP）
摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）持续给全球养猪业造成重大经济损失。先前其他课题组的研究表明，CD163是PRRSV脱壳和基因组释放所必需的。然而，CD163不与核衣壳（N）蛋白相互作用。在本研究中，通过敲低、过表达、抗体或IgG阻断、敲除和回补实验，证明了新生儿Fc受体（FcRn）对PRRSV感染是不可替代的。进一步首次揭示FcRn参与PRRSV脱壳，而非病毒吸附和内化。具体而言，FcRn被确定在早期内体中与CD163和PRRSV病毒粒子共定位，并特异性地与早期内体中的N蛋白相互作用。综上所述，这些结果提供了证据表明FcRn是PRRSV脱壳所必需的关键细胞因子，这将成为干扰病毒感染的有前景的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FcRn是否参与PRRSV感染，并在病毒感染过程中发挥何种作用？
- 核心机制
- FcRn在早期内体中与PRRSV N蛋白和M蛋白特异性相互作用，介导病毒脱壳和基因组释放，是PRRSV脱壳所必需的关键宿主因子。
- 主要证据
- 敲低和过表达实验证明FcRn调节PRRSV感染；抗体和IgG阻断实验抑制感染；CRISPR/Cas9敲除FCGRT或B2M使MARC-145细胞抵抗PRRSV感染，回补恢复感染；Co-IP证明FcRn与PRRSV N和M蛋白在早期内体中互作，并且不参与吸附和内化。
- 研究意义
- 该研究发现FcRn是PRRSV脱壳的关键宿主因子，为PRRSV感染的防治提供了新的靶点，并揭示了PRRSV早期感染机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FcRn抗体和IgG阻断实验
验证FcRn抗体和IgG能否阻断PRRSV感染。
用FCGRT pAb或B2M mAb预处理MARC-145细胞或PAMs，或用猪、兔、鼠IgG预处理PAMs，然后感染PRRSV FJ，检测病毒N蛋白表达和滴度。
CRISPR/Cas9敲除FCGRT、B2M、CD163
确定FcRn缺失对PRRSV感染的影响。
利用CRISPR/Cas9构建FCGRT-KO、B2M-KO、CD163-KO MARC-145细胞，感染多种PRRSV株，检测CPE、IFA、病毒蛋白和mRNA表达。
回补FcRn恢复病毒增殖
验证FcRn特异性回补是否恢复PRRSV感染。
在FCGRT-KO和B2M-KO细胞中表达外源FCGRT和B2M，或表达不同物种FCGRT，感染PRRSV FJ后检测病毒蛋白和滴度。
FcRn在病毒吸附和内化中的作用
区分FcRn在PRRSV感染过程中的作用阶段。
使用FCGRT-KO和WT MARC-145细胞进行吸附和内化实验，检测病毒RNA和N蛋白。
FcRn亚细胞定位和与病毒蛋白相互作用
确定FcRn与PRRSV蛋白在早期内体中的相互作用。
免疫荧光共定位和免疫共沉淀。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| Western blot | 抗FCGRT多克隆抗体 | proteintech | 16190-1-AP |
| 抗B2M单克隆抗体 | proteintech | 66207-1-Ig | |
| 小鼠IgG2b同型对照 | proteintech | 66360-3-Ig | |
| 免疫荧光 | 抗EEA1单克隆抗体 | proteintech | 68065-1-Ig |
| CoraLite647标记的山羊抗小鼠IgG | proteintech | SA00014-10 | |
| Western blot | 抗Cas9多克隆抗体 | ABclonal | A14997 |
| 抗FLAG单克隆抗体 | ABclonal | AE092 | |
| 抗HA单克隆抗体 | ABclonal | AE008 | |
| 抗Myc单克隆抗体 | ABclonal | AE070 | |
| 抗GAPDH单克隆抗体 | ABclonal | AC002 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | ABclonal | AS003 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | ABclonal | AS014 | |
| 免疫荧光 | ABflo594标记的山羊抗兔IgG | ABclonal | AS039 |
| ABflo594标记的山羊抗小鼠IgG | ABclonal | AS054 | |
| 抗体阻断实验 | 兔IgG同型对照 | ABclonal | AC042 |
| Western blot | 抗CD163单克隆抗体 | GeneTex | GTX42364 |
| 抗PRRSV N蛋白多克隆抗体 | GeneTex | GTX135351 | |
| 抗PRRSV M蛋白多克隆抗体 | GeneTex | GTX129063 | |
| 小鼠抗PRRSV M蛋白单克隆抗体 | GeneTex | GTX634651 | |
| 抗PRRSV GP5多克隆抗体 | GeneTex | GTX129062 | |
| 抗PRRSV GP3多克隆抗体 | GeneTex | GTX129272 | |
| 免疫荧光 | 抗PRRSV nsp1α多克隆抗体 | GeneTex | GTX133695 |
| 抗体阻断实验 | FITC标记的兔抗猪IgG | GeneTex | GTX26773 |
| 猪IgG | Bioss | bs-0309P | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000008 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | BS350A |
| 细胞染色 | DAPI | Solarbio | C0065 |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Beyotime | ST551 |
| 筛选 | 潮霉素B | Beyotime | ST1389 |
| 细胞培养 | 0.45µm过滤器 | Millipore | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript反转录试剂盒 | TaKaRa | -- |
| SYBR Green染料 | TaKaRa | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | BIO-RAD | -- | |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶 | EpiZyme | -- |
| ECL化学发光试剂盒 | ABclonal | RM00021 | |
| ChemiDoc XRS+凝胶成像系统 | BIO-RAD | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Selleck | B23201 |
| 荧光检测 | 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 显微镜 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss AG | LSM800 |
| 免疫荧光 | 倒置显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒接种 | 细胞类型、培养基、病毒株、MOI、感染时间 阅读提示：Materials and Methods - Cells and viruses; 图1-3图注 |
| FCGRT敲低 | shRNA序列、敲低验证时间、PRRSV感染时间 阅读提示：Materials and Methods - shRNA-mediated FcRn knockdown; 图1A-B图注 |
| FcRn过表达 | 质粒、转染时间、MOI、检测时间点 阅读提示：Materials and Methods - FcRn overexpression; 图1F-I图注 |
| 抗体/IgG阻断 | 抗体类型、浓度、预处理时间、感染时间 阅读提示：Materials and Methods - Antibodies and IgG blocking assay; 图2图注 |
| 基因敲除 | sgRNA序列、敲除验证、MOI、检测时间 阅读提示：Materials and Methods - Knockout cell lines establishment; 图3图注 |
| 回补实验 | 表达载体、筛选浓度和时长、MOI、检测时间 阅读提示：Materials and Methods - Construction of complemented cell lines; 图4图注 |
| 吸附和内化实验 | 低温吸附温度和时间、内化时间和温度、MOI 阅读提示：Materials and Methods - Virus attachment and internalization assays; 图5A-D图注 |
| 免疫共沉淀 | 感染MOI、裂解缓冲液pH、抗体和磁珠 阅读提示：Materials and Methods - Co-immunoprecipitation; 图6C-D图注 |