高通量筛选抗HCC化合物
从1444种生物活性化合物中筛选出能显著抑制HCC细胞增殖的候选药物。
使用CCK8和LDH释放实验在Hep3B细胞中进行初筛和复筛，评估化合物对细胞存活率的影响，最终确定DIG为候选药物。
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地高辛通过调节PI3K/AKT/mTOR通路激活肝细胞癌自噬
Digoxigenin activates autophagy in hepatocellular carcinoma cells by regulating the PI3K/AKT/mTOR pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK8、LDH、集落形成、划痕、透射电镜、Western blot、免疫荧光）、体内裸鼠移植瘤实验、网络药理学和分子对接，并进行了功能验证（自噬抑制剂3MA）和机制验证（mTOR抑制剂Rapa）。
主要模型
Hep3B人肝癌细胞系 Huh7人肝癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
DIG浓度（1-10 µM）和处理时间（24-48 h）对细胞增殖的影响 自噬抑制剂3MA（1 mM）对DIG诱导细胞死亡和自噬的逆转作用 mTOR抑制剂雷帕霉素（1 µM）对DIG诱导自噬和通路蛋白磷酸化的增强作用 体内实验中DIG剂量（2.8 mg/kg/天）、3MA（24 mg/kg/天）和Rapa（2 mg/kg/天）的腹腔注射给药方案 肿瘤体积和体重的测量时间（每日）及处理持续时间（10天）
摘要
肝细胞癌（HCC）被认为是一种高度恶性的肿瘤。靶向联合免疫治疗作为最初批准的方案，在临床治疗中受到不良反应和低应答率的损害。中药及其衍生的天然化合物以其抗癌作用而闻名，具有低毒和成本低的优势。在本研究中，我们进行了体外高通量表型筛选，以寻找有前景的抗HCC药物。在1444种生物活性化合物中，发现地高辛（DIG）能显著阻碍HCC细胞进展。我们通过CCK8细胞计数、乳酸脱氢酶和集落形成等检测验证了DIG的治疗效果。透射电子显微镜、蛋白质印迹和免疫荧光等分析表明，DIG通过自噬抑制HCC细胞增殖。网络药理学和分子对接研究表明，DIG靶向PI3K/AKT/mTOR信号通路。用DIG或mTOR抑制剂处理Hep3B和Huh7细胞的比较实验显示出相似的抑制效应，表明DIG通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导自噬。体内研究证实DIG可阻止皮下异种移植瘤的生长。总之，DIG通过调节PI3K/AKT/mTOR通路诱导自噬，是HCC的潜在治疗药物。这项研究通过表型筛选，加速了药物发现和针对肝癌潜在机制的新疗法的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 地高辛（DIG）是否能够通过诱导自噬抑制肝细胞癌（HCC）的进展，并阐明其潜在的分子机制。
- 核心机制
- DIG通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，特别是与mTOR强结合，降低PI3K、AKT、mTOR的磷酸化水平，从而促进自噬流，诱导HCC细胞自噬性死亡。
- 主要证据
- 体外实验显示DIG抑制HCC细胞增殖、迁移和集落形成，增加自噬体形成和LC3B-II表达，降低p62水平；3MA逆转这些效应；体内实验中DIG抑制移植瘤生长，并降低肿瘤组织中p-mTOR和LC3B表达。
- 研究意义
- 研究提出DIG作为天然化合物，通过诱导自噬抑制HCC，为肝癌治疗提供新策略和潜在候选药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证DIG的抗增殖和抗迁移效应
验证DIG对HCC细胞增殖、集落形成和迁移能力的抑制作用。
使用CCK8、集落形成、划痕实验和Western blot检测迁移相关蛋白（RHOA、RAC1）表达，评估DIG处理的效果。
验证DIG诱导自噬
确定DIG是否通过诱导自噬导致HCC细胞死亡。
通过透射电镜观察自噬体形成，Western blot检测LC3B和p62表达，免疫荧光检测LC3B斑块，并使用自噬抑制剂3MA和Baf-A1进行处理。
预测并验证PI3K/AKT/mTOR通路
探索DIG抑制HCC的潜在分子机制，特别是PI3K/AKT/mTOR通路。
通过网络药理学预测DIG的靶点，KEGG富集分析；Western blot检测通路蛋白磷酸化水平；RT-qPCR检测mRNA水平；分子对接分析DIG与PI3K、AKT、mTOR的结合能力。
使用mTOR抑制剂验证通路特异性
通过mTOR抑制剂雷帕霉素验证DIG是否通过抑制mTOR通路诱导自噬。
使用雷帕霉素预处理HCC细胞，CCK8检测细胞存活率，免疫荧光检测LC3B，Western blot检测通路蛋白和自噬蛋白表达。
体内验证DIG的抗肿瘤效应
评估DIG在体内对HCC移植瘤生长的抑制作用及对肝脏功能的影响。
在BALB/c裸鼠皮下接种Huh7细胞建立移植瘤模型，腹腔注射DIG、DIG+3MA、DIG+Rapa或生理盐水，连续10天，测量肿瘤体积和体重，检测血清ALT/AST，并通过H&E染色和免疫组化分析肿瘤组织。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 3-甲基腺嘌呤 | Selleck Chemicals | S2767 |
| Ac DEVD CHO | Selleck Chemicals | S7901 | |
| 巴佛洛霉素A1 | Meilunbio | MB5505-L | |
| 铁死亡抑制剂-1 | MedChem Express | HY-100579 | |
| 雷帕霉素 | MedChem Express | AY-22989 | |
| 细胞培养 | DMEM高糖培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK8试剂 | Beyotime | C0043 |
| LDH检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | C0017 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A211 |
| 免疫荧光 | Cy3标记的山羊抗兔IgG | Invitrogen | A-10520 |
| DAPI即用型溶液 | Sorabio | C0065 | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Scientific | 89900 |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23277 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | BIO-RAD | -- | |
| 超灵敏电化学发光液 | Millipore Sigma | WBKLS0500 | |
| RT-qPCR | AGRNAex RNA提取试剂 | Accurate Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 逆转录试剂盒 | Jiangsu Accuracy Biotechnology Co., Ltd. | AG11728 | |
| SYBR预混试剂盒 | Jiangsu Accuracy Biotechnology Co., Ltd. | AG11718 | |
| 免疫组化 | 柠檬酸溶液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0086 |
| 二抗 | MXB Biotechnologies | KIT5020 | |
| DAB显色液 | MXB Biotechnology Co., Ltd. | DAB-0031 | |
| 血清ALT/AST检测 | ALT检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | C00921 |
| AST检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | C01021 | |
| 抗体（Western blot, 免疫荧光, 免疫组化） | LC3I/II抗体 | Sigma-Aldrich | L7543 |
| 抗体（Western blot） | p62抗体 | Sigma-Aldrich | P0068 |
| AKT抗体 | ImmunoWay | YT0185 | |
| p-AKT (Ser473)抗体 | ImmunoWay | YP0006 | |
| p-70S6K (Tr389)抗体 | ImmunoWay | YP1427 | |
| PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4249T | |
| p-mTOR (Ser2448)抗体 | Cell Signaling Technology | 2971 | |
| mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983T | |
| LC3I/II抗体 | Cell Signaling Technology | 2775 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 14C10 | |
| p-PI3K抗体 | Bioss | bs-6417R | |
| Rac1抗体 | Servicebio | GB11621 | |
| RHOA抗体 | Proteintech | 10749-1-AP | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG (H+L)交叉吸附二抗 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基类型：Hep3B、Huh7、HCCLM3、HepG2使用DMEM高糖培养基；AML-12使用专用培养基；MIHA使用RPMI-1640。所有培养基补充10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。 阅读提示：见Materials and methods: Cell culture |
| 药物处理 | DIG浓度范围1-10 µM，处理时间24-48 h；3MA预处理浓度1 mM，预处理时间1 h；Rapa预处理浓度1 µM，预处理时间1 h。 阅读提示：见Materials and methods: Cell viability assay 和 Results |
| 体外细胞增殖检测 | 细胞接种密度：CCK8和LDH为1×10^4细胞/孔（96孔板）；集落形成500细胞/孔（6孔板）；划痕实验4×10^5细胞/孔（6孔板）。 阅读提示：见Materials and methods: Cell viability assay, LDH assay, Colony formation assay, Cell scratch test |
| 自噬检测 | 透射电镜：DIG浓度2 µM，处理48 h；3MA预处理浓度1 mM，时间1 h；免疫荧光：LC3抗体稀释1:200；Western blot检测LC3B和p62。 阅读提示：见Materials and methods: Transmission electron microscopy, Immunofluorescence, Western blot |
| 通路检测 | Western blot检测p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K，DIG浓度2 µM处理48 h；RT-qPCR检测PIK3CA、AKT1、mTOR mRNA水平。 阅读提示：见Materials and methods: Western blot, RT-qPCR; Results: 图4 |
| 体内动物实验 | BALB/c裸鼠（4周龄，雄性），皮下接种Huh7细胞1×10^7；分组：对照组（0.9% NaCl）、DIG（2.8 mg/kg/天）、DIG+3MA（24 mg/kg/天）、DIG+Rapa（2 mg/kg/天）；腹腔注射，连续10天；每组6只。 阅读提示：见Materials and methods: 使用裸鼠模型作为肿瘤和给药 |