多组学数据生成和质量控制
建立颅底脊索瘤的基因组、转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组图谱，确保数据质量可靠。
对187例肿瘤样本进行全外显子测序（WES）、RNA测序（RNA-seq）、蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析。通过标准品相关性、主成分分析等方法进行质量控制。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
颅底脊索瘤的蛋白质基因组学特征
Proteogenomic characterization of skull-base chordoma.
实验完整度
高研究包含多组学分析（基因组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组）、体外细胞功能实验（CIN诱导、siRNA敲低、放疗敏感性）及配对样本验证，证据层级独立。
主要模型
187例颅底脊索瘤肿瘤样本（含121例原发，66例复发） UM-Chor1细胞系 CIN诱导的UM-Chor1单克隆细胞系 患者来源的原代细胞
重点核对
CIN状态分类：基于WES数据的CIN评分，截断值0.341 放疗分组：低剂量（<60 Gy）与高剂量（>60 Gy），放疗敏感与抵抗定义（3年内复发） RPRD1B敲低：siRNA转染，放疗剂量32Gy和64Gy CIN诱导：阿糖胞苷处理（10 nM）3天 配对样本：17对复发前后肿瘤样本
摘要
颅底脊索瘤是一种罕见的、侵袭性强的骨癌，复发率高。尽管基因组学研究取得了进展，但其分子特征和有效疗法仍然未知。在此，我们对187例颅底脊索瘤肿瘤进行了整合基因组学、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。在我们的研究中，染色体不稳定性被确定为预后预测因子和潜在治疗靶点。多组学数据揭示了染色体不稳定性的下游效应，其中RPRD1B被认为是放疗抵抗患者的推定靶点。与染色体不稳定性和线粒体功能上调相关的染色体1q增益导致较差的临床结果。免疫亚型分析确定了一种与染色体9p/10q缺失和免疫逃逸相关的免疫冷亚型。基于蛋白质组学的分类揭示了具有高染色体不稳定性和免疫冷特征的亚型（P-II和P-III），其中P-II肿瘤表现出增加的侵袭性。这些发现已在17对配对样本中得到证实，为颅底脊索瘤的生物学和治疗提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 颅底脊索瘤的分子特征、预后标志物及潜在治疗靶点是什么？
- 核心机制
- 染色体不稳定性（CIN）主要由DNA复制应激引起，通过E2F3转录活性上调促进细胞周期进展和增殖，并通过抑制凋亡导致肿瘤进展。1q增益通过上调线粒体蛋白稳态相关基因（如HSPD1、HSPE1、DNAJA3）与不良预后相关。RPRD1B表达上调促进DNA修复（同源重组和错配修复），导致放疗抵抗。9p/10q缺失导致免疫逃逸。
- 主要证据
- 基于187例肿瘤的多组学分析（WES、RNA-seq、蛋白质组、磷酸化蛋白质组）发现CIN与不良预后相关，并通过体外实验（CIN诱导的细胞系、siRNA敲低）验证了E2F3、RPRD1B的功能，以及17对配对样本的验证。
- 研究意义
- 研究为颅底脊索瘤的预后预测和治疗策略提供了多组学资源，提示CIN状态可作为预后标志物，并提出了潜在治疗靶点（如E2F3、RPRD1B、IRF1）和亚型指导的个性化治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
染色体不稳定性（CIN）评估和预后关联
评估CIN状态与患者预后（OS、PFS）及复发的关系，并验证其可靠性。
基于WES数据计算CIN评分（非整倍体片段比例），将样本分为CIN+和CIN-，进行生存分析和比较原发、复发肿瘤的CIN得分。使用T2T参考基因组和FISH验证CIN评分和特定染色体臂事件。
CIN驱动机制研究：DNA复制应激与E2F3
探究CIN+肿瘤中DNA复制应激及其下游信号通路（E2F转录活性）的作用。
通过ssGSEA比较CIN+与CIN-肿瘤的分子通路，分析DNA复制应激通路、E2F靶基因表达、激酶活性（KSTAR），并通过IHC和细胞实验验证。
细胞实验验证CIN功能
验证CIN对细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。
用阿糖胞苷处理UM-Chor1细胞诱导CIN，通过WES、FISH、LC-MS/MS验证CIN状态，检测增殖曲线（CellTiter-Glo）、细胞周期（流式）和凋亡（Annexin V/PI）。
染色体1q增益效应研究
明确1q增益对预后的影响及其下游分子通路（线粒体功能）。
分析1q增益与CIN、预后的关联，通过cis/trans效应筛选1q基因，富集分析显示线粒体通路富集，通过免疫组化（ATP5A1、TOMM20）和siRNA敲低（HSPD1、HSPE1、DNAJA3）验证线粒体蛋白稳态的影响。
放疗抵抗机制研究：RPRD1B
识别放疗抵抗的潜在生物标志物并验证其功能。
将放疗前肿瘤样本分为敏感和抵抗组，比较蛋白质表达，发现RPRD1B高表达与放疗抵抗相关。通过siRNA敲低RPRD1B检测放疗敏感性（32Gy/64Gy），并分析DNA修复通路（HDR、MMR）。
免疫亚型分析
揭示SBC的免疫微环境异质性及其与CIN和特定染色体臂缺失的关联。
使用xCell对RNA-seq数据进行细胞类型反卷积，聚类得到Hot、Cold、Mix亚型，分析免疫评分与CIN的负相关，以及9p/10q缺失对免疫通路的影响。
免疫逃逸机制验证
验证9p/10q缺失导致的免疫抑制效应。
将9p/10q缺失的CIN+细胞系与T细胞共培养，检测IFN产生和T细胞杀瘤能力，并测试抗PD-L1（atezolizumab）的作用。
蛋白质组亚型分析
基于蛋白质组数据对SBC进行分子分型，并探究亚型间的预后差异和分子特征。
使用共识聚类（基于前30%最可变蛋白）识别出4个亚型（P-I至P-IV），分析各亚型的CIN评分、免疫评分、生存差异和通路富集。
配对样本分析
验证原发和复发肿瘤的分子差异，并探究CIN状态变化与预后的关系。
对17对原发和复发肿瘤进行WES、RNA-seq、蛋白质组比较，分析CIN评分变化、通路差异和临床相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA纯化试剂盒 | Promega | -- |
| QIAamp DNA血液迷你试剂盒 | Qiagen | 51106 | |
| DNA质量检测 | Qubit 3.0荧光计dsDNA HS检测 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NanoDrop2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| WES文库制备 | Covaris LE220超声破碎仪 | Covaris | -- |
| SureselectXT试剂盒 | Agilent | -- | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman | -- | |
| Herculase II融合DNA聚合酶 | Agilent | -- | |
| SureSelect人类全外显子V5试剂盒 | Agilent | -- | |
| WES测序 | Agilent BioAnalyzer 4200生物分析仪 | Agilent | -- |
| Illumina NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA提取 | TIANGEN® RNAprep Pure FFPE试剂盒 | TIANGEN | DP439 |
| RNA-seq文库制备 | Ribo-off® rRNA去除试剂盒 | Vazyme | N406 |
| VAHTS® Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme | N401-NR604 | |
| 蛋白质提取 | 二硫苏糖醇 | Sigma | 43815 |
| 蛋白质消化 | Microcon过滤器管 | Sartorius | -- |
| 磷酸化肽富集 | High-Select™ Fe-NTA磷酸化肽富集试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy nLC-1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Nanoflex离子源 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质组学数据分析 | Firmiana平台 | -- | -- |
| 免疫组化 | 抗TBXT抗体 | abcam | ab209665 |
| 抗ATP5A抗体 | abcam | ab14748 | |
| 抗MSH2抗体 | abcam | ab70270 | |
| 抗TOMM20抗体 | CST | 42406S | |
| 磷酸化Rb (Ser807/811)抗体 | CST | 8516T | |
| 免疫荧光 | 抗ERCC6L (PICH)抗体 | Bioss | bs-6380R |
| 抗BLM抗体 | Sigma-Aldrich | HPA005689 | |
| DAPI Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 细胞培养 | IMDM培养基 | Gibco | 12440053 |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | A1049101 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 抗生素混合物 | Gibco | 15240062 | |
| MycoBlue支原体检测试剂 | Vazyme | D101-01 | |
| 细胞转染 | RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778030 |
| 细胞照射 | 小动物辐射研究平台 (SARRP) | Gulmay Medical Co., Ltd | -- |
| Western blotting | SDS细胞裂解液 | Beyotime | P0013G |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 87785 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 抗GAPDH抗体 | abcam | ab181602 | |
| 抗α-tubulin抗体 | ptmbiolabs | PTM-5442 | |
| 抗兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗鼠IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗RPRD1B抗体 | GeneTex | GTX119969 | |
| 抗HSPD1抗体 | Cell Signaling Technology | 12165S | |
| 抗HSPE1抗体 | Absin | abs146058 | |
| 抗DNAJA3抗体 | Proteintech | 11088-1-AP | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| SuperScript III第一链cDNA合成系统 | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green PCR预混液 | Vazyme | Q331-02 | |
| 实时荧光定量PCR仪（iQ5） | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 细胞增殖分析 | CCK-8试剂盒 | Yeasen | 40203ES92 |
| 细胞周期和凋亡分析 | 碘化丙啶 | Vazyme Biotech | A211-01 |
| BD FACSCalibur流式细胞仪 | BD Pharmingen | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 原代细胞分离 | 人肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| FISH分析 | GSP 1q21/1p36探针 | Anbiping company | -- |
| GSP 9p21/CSP9探针 | Anbiping company | -- | |
| GSP 10q23/CSP10探针 | Anbiping company | -- | |
| 免疫检测 | 阿替利珠单抗 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集和肿瘤纯度评估 | FFPE样本的肿瘤纯度>70%，由两名病理学家确认 阅读提示：Methods: Sample selection, Tumor purity |
| 全外显子测序和CIN评分 | WES平均深度200X，CIN评分计算方法及截断值0.341 阅读提示：Methods: Whole-exome sequencing, Classification of samples with CIN |
| 放疗抵抗分组 | 放疗剂量分组（低剂量<60 Gy, 高剂量>60 Gy），放疗抵抗定义（3年内复发） 阅读提示：Methods: Radio-resistance degree definition |
| 细胞培养和转染 | UM-Chor1细胞系培养条件，siRNA转染浓度（50 nM） 阅读提示：Methods: Cell culture, Cell transfection |
| CIN诱导 | 阿糖胞苷浓度（10 nM）和处理时间（3天） 阅读提示：Methods: CIN induction experiment |
| 放疗处理 | 辐照剂量：32Gy和64Gy 阅读提示：Methods: Radiation of cell lines |
| 细胞活力检测 | 细胞活力检测方法（CellTiter-Glo）和细胞接种密度（3000细胞/孔） 阅读提示：Methods: Cell viability assay |