重组蛋白表达与纯化
获得用于相互作用分析的重组RBD和hACE2蛋白
在Neuro2a细胞中表达ER-mCherry-RBDWh1、ER-mCherry-RBDOmic和hACE2-eGFP，并纯化重组蛋白。
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SARS-CoV-2奥密克戎变异株受体结合域与hACE2和肌动蛋白的相互作用
Interaction of Receptor-Binding Domain of the SARS-CoV-2 Omicron Variant with hACE2 and Actin.
实验完整度
中包含FCCS检测RBD与hACE2亲和力、免疫共沉淀联合质谱鉴定肌动蛋白、共聚焦显微镜定位分析及蛋白质复合物预测等体外和计算验证，但缺乏动物或患者样本等独立证据层级。
主要模型
Neuro2a细胞（重组蛋白表达） HeLa细胞（共定位分析）
重点核对
重组蛋白表达与纯化（Neuro2a细胞） FCCS测量RBD与hACE2的相互作用 免疫共沉淀及质谱鉴定RBD结合蛋白 共聚焦显微镜观察RBD与肌动蛋白共定位
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的奥密克戎变异株于2021年被发现，与之前的变异株相比，其刺突蛋白（大多数疫苗的靶点）存在大量氨基酸突变。刺突蛋白中的氨基酸替换可能改变其与宿主病毒受体及宿主相互作用组的亲和力。在本研究中，我们发现，与原型RBD相比，SARS-CoV-2奥密克戎变异株的受体结合域（RBD）对宿主细胞受体人血管紧张素转换酶2的亲和力增强。此外，我们鉴定出β-肌动蛋白和γ-肌动蛋白是RBD的奥密克戎特异性结合伙伴。蛋白质复合物预测显示，许多奥密克戎特异性氨基酸替换影响了奥密克戎变异株RBD与肌动蛋白之间的亲和力。我们的研究结果表明，定位于不同细胞区室的蛋白质与奥密克戎RBD表现出强结合。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 奥密克戎变异株RBD与hACE2的亲和力是否较原型RBD增强，以及RBD是否与宿主细胞内的其他蛋白发生相互作用？
- 核心机制
- 奥密克戎RBD通过其特异性氨基酸突变增强了与hACE2的亲和力，并能够与胞质中的β-和γ-肌动蛋白结合。
- 主要证据
- FCCS显示奥密克戎RBD与hACE2的RCA显著高于原型；免疫共沉淀结合质谱和Western blot鉴定出β-和γ-肌动蛋白是奥密克戎RBD的特异性结合蛋白，而原型RBD未检出。
- 研究意义
- 本研究提出FCCS可作为快速验证中和抗体和小分子药物抑制RBD/hACE2相互作用的方法，并揭示肌动蛋白作为奥密克戎RBD的强结合伙伴，但其在细胞质中的具体作用尚需进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FCCS检测RBD与hACE2的亲和力
比较奥密克戎和原型RBD与hACE2的结合亲和力
将纯化的RBD与hACE2混合，进行FCCS测量，计算相对交叉相关振幅（RCA）。
鉴定RBD结合蛋白
寻找奥密克戎RBD特有的结合伙伴
对纯化的RBD蛋白进行SDS-PAGE和银染，差异条带经MALDI-TOF-MS鉴定，并用Western blot验证。
共定位分析
检验RBD在细胞内是否与肌动蛋白丝共定位
在HeLa细胞中共表达mCherry-RBD（Wh1或Omic）与eGFP-β-actin，或使用phalloidin染色，用共聚焦显微镜观察共定位情况。
蛋白质复合物预测
预测奥密克戎RBD与β-肌动蛋白复合物的结构，以识别关键氨基酸
使用ColabFold预测RBDOmic与β-actin的蛋白质复合物结构，并分析奥密克戎特异性突变位点与肌动蛋白表面的距离。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达和纯化
鉴定结合蛋白
亚细胞定位分析
蛋白质结构预测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | -- |
| 显微成像 | LSM510 META | Carl Zeiss | -- |
| C-Apochromat 40×/1.2 NA Korr UV-VIS-IR水浸物镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 免疫荧光染色 | 鬼笔环肽-iFluor 488 | Cayman | -- |
| 银染 | 银染试剂盒 | Cosmo Bio | 423413 |
| Western blotting | PVDF膜 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 抗GFP HRP-DirecT抗体 | MBL | 598-7 | |
| 抗mCherry抗体 | TaKaRa | Z2496N | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| 抗γ-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 11227-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| CanGet Signal免疫反应增强液1 | TOYOBO | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| FCCS | ConfoCor 3 | Carl Zeiss | -- |
| 蛋白表达 | Neuro2a细胞 | ATCC | CCL-131 |
| 显微成像 | HeLa细胞 | RIKEN BRC | RCB0007 |
| 细胞培养 | 盖玻片培养室 | IWAKI | 5222-004 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | Neuro2a细胞培养条件、转染方法、蛋白纯化步骤 阅读提示：Methods 2.1和2.2 |
| FCCS检测 | 仪器设置、荧光标记、缓冲液组成、蛋白浓度 阅读提示：Methods 2.6 |
| 免疫共沉淀与质谱 | 裂解条件、抗体使用、银染及质谱分析条件 阅读提示：Methods 2.4和2.5 |
| 共聚焦成像 | HeLa细胞培养、转染量、固定和染色条件 阅读提示：Methods 2.3 |