建立hESC向角膜角质细胞的分化方案
验证从hESC分化为NCCs及角膜角质细胞的可行性。
两步分化策略：先将hESC在NDM（含4 ng/mL bFGF和1 μM RA）中培养5天诱导为NCCs，再在KDM（含10 ng/mL bFGF等）中培养2-3周分化为角膜角质细胞。通过免疫荧光和qPCR检测标志物表达。
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RAD21缺陷通过上调WNT9B驱动角膜向巩膜分化命运转换
RAD21 deficiency drives corneal to scleral differentiation fate switching via upregulating WNT9B.
实验完整度
高包含hESC体外分化模型、RNA-seq转录组分析、Xenopus胚胎体内过表达验证及挽救实验，涵盖细胞功能与体内表型验证。
主要模型
hESC来源的神经嵴细胞（NCCs） hESC来源的角膜角质细胞 Xenopus tropicalis胚胎
重点核对
hESC分化为NCCs和角膜角质细胞的阶段性方案（NDM含4 ng/mL bFGF和1 μM RA培养5天；KDM含10 ng/mL bFGF培养2-3周） siRNA敲低RAD21（90 nM siRNA，Lipofectamine RNAiMAX转染） 过表达PCDHGC3或WNT9B的质粒转染（FuGENE） Xenopus胚胎单侧注射wnt9b mRNA（200 pg）和GFP mRNA（100 pg）
摘要
角膜和巩膜是相邻但不同的组织，然而它们的基质细胞源自共同的神经嵴细胞（NCCs）。巩膜角膜是一种以角膜和巩膜之间边界无法区分为特征的疾病。此前，我们在一个巩膜角膜家系中鉴定出RAD21突变。在此，我们研究了RAD21对眼发育过程中NCC活性的影响。RAD21缺陷导致PCDHGC3上调。RAD21敲低和PCDHGC3上调均破坏了NCC的迁移。转录组分析表明，WNT9B在巩膜基质中的表达比角膜基质高190.9倍。WNT9B也因RAD21敲低和PCDHGC3过表达而显著上调，而敲低WNT9B则挽救了RAD21缺陷NCC的分化和迁移。一致地，在热带爪蟾中过表达wnt9b导致眼部发育异常。总之，WNT9B是NCC分化为角膜角质细胞或巩膜基质细胞过程中的决定因素，并受RAD21表达的影响。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RAD21缺陷是否通过影响神经嵴细胞（NCCs）的分化命运决定和迁移，导致角膜向巩膜样分化，并涉及何种下游机制。
- 核心机制
- RAD21缺陷上调PCDHGC3和WNT9B，WNT9B作为关键下游因子促进NCCs向巩膜基质细胞分化并抑制角膜角质细胞分化，同时影响NCCs迁移，进而导致眼部发育异常。
- 主要证据
- 通过hESC来源的NCCs，RAD21敲低导致角膜标志物（KERA、LUM）下调，巩膜标志物（VIM、MGP）上调；WNT9B敲低可挽救RAD21敲低引起的分化和迁移缺陷；在Xenopus胚胎中过表达wnt9b导致颅神经嵴细胞迁移异常和眼发育畸形。
- 研究意义
- 该研究揭示了RAD21-WNT9B轴在神经嵴细胞分化命运决定中的作用，为巩膜角膜的发病机制提供了新见解，并可能为相关疾病的干预提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RAD21敲低对NCC活性的影响
评估RAD21缺失对NCC增殖、衰老和分化命运的影响。
在hESC向NCC分化过程中用siRNA敲低RAD21，检测NCC增殖（Ki67）、衰老（SA-β-gal）及分化后角膜/巩膜标志物表达。
PCDHGC3在RAD21下游的作用验证
验证PCDHGC3是否为RAD21影响NCC活性的下游效应因子。
检测RAD21敲低后PCDHGC3表达，过表达PCDHGC3观察分化标志物变化，并通过共敲低RAD21和PCDHGC3进行挽救实验，同时进行划痕和Transwell迁移实验。
RNA-seq筛选巩膜倾向相关下游因子
识别RAD1敲低和PCDHGC3过表达共同上调的巩膜分化相关基因。
对4个人角膜基质和4个人巩膜基质样本，以及RAD21敲低、PCDHGC3过表达的细胞样本进行RNA-seq，并进行差异表达、GO富集和WNT通路交叉分析。
验证WNT9B作为RAD21下游因子的功能
验证WNT9B是否介导RAD21对NCC分化和迁移的影响。
在NCCs中过表达WNT9B观察分化标志物变化，共敲低RAD21和WNT9B进行挽救实验，检测分化标志物和迁移能力。
Xenopus体内过表达wnt9b验证
在体内验证wnt9b过表达对颅神经嵴细胞迁移和眼发育的影响。
将wnt9b mRNA和GFP mRNA注射到2细胞期Xenopus胚胎的一个细胞，通过原位杂交检测NCC标志物（ap2α、twist1）和pitx2，并观察眼形态。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR1培养基 | STEMCELL | 85850 |
| 基质胶 | Corning | BD354277 | |
| ReLeSR细胞解离试剂 | STEMCELL | 100-0483 | |
| Y-27632 | STEMCELL | 72302 | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | 11330032 | |
| 敲除血清替代物 | Gibco | 10828028 | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 维甲酸 | Sigma | 223018 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Proteintech | 78003.1 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma | 49752 | |
| Accutase细胞解离液 | STEMCELL | 07920 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Gibco | 41400045 | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778150 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985062 | |
| FuGENE转染试剂 | Promega | E2311 | |
| 细胞培养 | L-谷氨酰胺补充剂 | Gibco | 35050061 |
| 免疫染色 | DAPI | Solarbio | C0065 |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 组织分离 | 分散酶II | Roche | 04942078001 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018CN |
| 免疫染色 | TritonX-100 | Solarbio | 9002-93-1 |
| 衰老检测 | 衰老相关β-半乳糖苷酶染色 | Cell Signaling | 9860 |
| RNA提取 | MiniBEST通用RNA提取试剂盒 | TaKaRa | 9767 |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa | RR037A |
| FastStart Universal SYBR Green预混液 | Roche | 4913714001 | |
| PCR产物纯化 | QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 |
| 体外转录 | Transcript Aid T7高产转录试剂盒 | ThermoFisher Scientific | K0441 |
| 凝胶提取 | QIAquick凝胶提取试剂盒 | Qiagen | 28704 |
| 克隆 | pEASY-Blunt zero克隆试剂盒 | TransGen Biotec | CB501-01 |
| 体外转录 | mMESSAGE mMACHINE SP6试剂盒 | ThermoFisher Scientific | AM1340 |
| 抗体 | RAD21抗体 | Abcam | ab217678 |
| AP2α抗体 | Abcam | ab52222 | |
| AP2β抗体 | Immunoway | YN3852221094 | |
| AP2β抗体 | Abcam | ab221094 | |
| PITX2抗体 | Abcam | ab98297 | |
| SOX10抗体 | Abcam | ab155279 | |
| P75抗体 | Proteintech | 55014-1-AP | |
| KERA抗体 | Bioss | bs-11054R | |
| LUM抗体 | Abcam | ab168348 | |
| DCN抗体 | Abcam | ab175404 | |
| OCT4抗体 | Abcam | ab18976 | |
| NANOG抗体 | Abcam | ab80892 | |
| VIM抗体 | Abcam | ab8978 | |
| GAPDH抗体 | Sungene Biotech | LK9002 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分化 | 分化培养基组分、细胞因子浓度、分化时间 阅读提示：STAR★Methods中的'Neural crest cells and corneal keratocyte differentiation' |
| siRNA敲低 | siRNA浓度、转染试剂用量 阅读提示：STAR★Methods中的'siRNA knockdown' |
| 基因过表达 | 质粒载体、转染试剂和细胞数量 阅读提示：STAR★Methods中的'Overexpressing plasmid construction and transfection' |
| 细胞迁移实验 | 划痕实验和Transwell实验的细胞密度、时间点 阅读提示：STAR★Methods中的'Transwell assay'和'Scratch assay' |
| Xenopus胚胎实验 | 注射剂量、胚胎阶段、分析时期 阅读提示：STAR★Methods中的'In vitro transcription and microinjection with X. tropicalis embryos' |