单细胞数据处理与细胞注释
获得高质量的单细胞数据并识别细胞类型。
对GSE149614数据集进行质量控制（基因数>200且<8000，线粒体基因比例<10%），使用Seurat和Harmony进行标准化、批次效应校正和聚类，结合singleR注释出8种细胞类型。
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基于单细胞RNA测序和批量RNA测序构建与肝细胞癌及泛癌中ADCP相关的免疫和预后特征
Constructing immune and prognostic features associated with ADCP in hepatocellular carcinoma and pan-cancer based on scRNA-seq and bulk RNA-seq.
实验完整度
中包含生信分析（scRNA-seq、bulk RNA-seq、LASSO Cox等）和体外实验（RT-qPCR、IHC、划痕、Transwell），但缺乏体内和功能机制验证。
主要模型
TCGA-LIHC队列（374例肿瘤，50例正常） GSE149614单细胞数据集（60,288个细胞） 肝癌细胞系（HepG2, Hep3B, Huh7, HCCLM3, PLC/PRF/5） 正常人肝细胞系（LO2, Chang liver, WRL68）
重点核对
ADCP基因集来源于Kamber RA等人（PMID: 34497417）的620个基因。 LASSO Cox回归筛选出3个基因（GYPA、CLDN18、IRX5）建立风险模型，公式为风险评分=GYPA×0.159+CLDN18×0.118+IRX5×0.096。 实验验证使用肝癌细胞系HepG2和Hep3B，siRNA敲低CLDN18（si-CLDN18-#1和#3）。 RT-qPCR检测中，正常肝细胞系和肝癌细胞系各使用6个样本，组织样本15对。 免疫组化染色使用CLDN18抗体（#21126-1-AP, Proteintech）和GYPA抗体（#bs-2575R, Bioss）。
摘要
目的：尽管肝细胞癌（LIHC）的全身治疗取得了显著疗效，但客观现实是，目前只有少数患者对免疫治疗表现出改善的客观缓解率（ORR）。抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）免疫治疗被认为是精准免疫治疗的新引擎。基于此，我们旨在开发基于ADCP的LIHC风险分层系统，并筛选相关靶点。方法：结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和批量RNA测序数据，我们筛选了LIHC中的ADCP调节因子，并鉴定了差异表达基因及其涉及的功能通路。通过LASSO Cox回归分析，我们鉴定了具有预后价值的ADCP相关基因，建立了风险评分模型。随后对该风险评分模型进行了免疫浸润和免疫治疗相关性评估，并对关键靶点进行了泛癌分析和体外实验研究。结果：在Kamber RA等人的研究基础上，我们确定了GYPA、CLDN18和IRX5是调节LIHC中ADCP的潜在关键靶基因。这些基因与M1型巨噬细胞等免疫浸润细胞、LIHC免疫治疗疗效显著相关，并且与临床病理分期和患者预后密切相关。泛癌分析显示，CLDN18在多种癌症类型中具有预后和免疫相关性。通过组织和细胞样本验证，证实GYPA和CLDN18在肝癌组织和细胞中上调。此外，体外敲低CLDN18抑制了肝癌细胞的恶性能力。结论：我们在LIHC中鉴定了一个包含三个基因的ADCP特征。基于这三个基因的风险评分模型分析，结合后续实验验证，证实了M1型巨噬细胞在LIHC ADCP中的关键作用，确立CLDN18为LIHC中关键的ADCP调节靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用ADCP相关基因对肝细胞癌（LIHC）进行风险分层并筛选免疫治疗靶点？
- 核心机制
- 低风险组以M1型巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞浸润为主，而高风险组以M2型巨噬细胞富集，M1型巨噬细胞介导的ADCP效应更强，CLDN18可能通过增强肿瘤细胞屏障功能抵抗ADCP并促进肿瘤恶性行为。
- 主要证据
- 基于TCGA和GSE149614数据，通过LASSO Cox回归建立GYPA、CLDN18和IRX5风险模型，并验证CLDN18在肝癌组织及细胞中上调，敲低CLDN18抑制HepG2和Hep3B细胞迁移。
- 研究意义
- 本研究首次全面分析ADCP相关基因在LIHC中的调控，确定了ADCP特征、风险模型及CLDN18作为潜在免疫治疗靶点，为LIHC的精准免疫治疗提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异表达分析和ADCP相关基因筛选
鉴定正常与肿瘤组织间差异表达基因，并筛选ADCP相关基因。
对单细胞数据及TCGA-LIHC表达数据分别进行差异分析，与ADCP基因集取交集，得到15个ADCP相关基因，并进行GO/KEGG富集分析。
构建预后风险模型
建立基于ADCP相关基因的风险评分模型以预测LIHC患者预后。
使用R caret包将TCGA样本随机分为训练集和测试集，通过LASSO Cox回归筛选出3个基因（GYPA、CLDN18、IRX5）并计算风险评分，根据中位风险评分划分高低风险组。
免疫浸润和免疫治疗反应评估
分析风险模型与免疫细胞浸润及免疫治疗疗效的关系。
使用CIBERSORT算法评估22种免疫细胞比例，使用ESTIMATE计算免疫评分、基质评分和肿瘤纯度，并使用IMvigor210队列预测免疫治疗反应，通过Spearman相关分析药物敏感性。
CLDN18泛癌分析
评估CLDN18在多种癌症中的表达、预后及免疫相关性。
分析CLDN18在泛癌中的表达水平、与癌症进展和预后的关系，并计算其与TMB、MSI及免疫浸润的相关性。
实验验证关键基因表达
验证GYPA和CLDN18在肝癌组织和细胞中的表达情况。
通过免疫组织化学染色检测肝癌及癌旁组织中GYPA和CLDN18蛋白水平，并通过RT-qPCR检测mRNA水平，同时比较正常肝细胞系和肝癌细胞系中的表达。
体外敲低CLDN18验证功能
验证CLDN18对肝癌细胞迁移能力的影响。
使用siRNA转染HepG2和Hep3B细胞敲低CLDN18，通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
差异表达分析
免疫治疗反应预测
药物敏感性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | 逆转录试剂盒 | Toyobo | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green预混液 | Toyobo | -- |
| 免疫组化 | CLDN18抗体 | Proteintech | 21126-1-AP |
| GYPA抗体 | Bioss | bs-2575R | |
| 转染 | jetPRIME®转染试剂 | Polyplus | -- |
| 显微镜 | 显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞数据质量控制 | 细胞过滤条件：基因数在100-6000之间（结果中数值为>200和<8000），UMI>200，线粒体基因比例<10%；聚类分辨率0.5。 阅读提示：见Methods中'Single-cell data quality control'和'Cluster analysis'，以及Figure 1 |
| 差异表达分析 | 显著性阈值：|logFC|>2，p<0.05；TCGA数据中差异基因数量。 阅读提示：见Methods中'RNA isolation'和Results中'Analysis of genes associated with ADCP'，Figure 4 |
| 构建预后模型 | LASSO Cox回归的参数（如λ值）；训练集与测试集划分比例0.7:0.3；风险评分公式系数。 阅读提示：见Methods中'Construction of clinical prognosis model'，Results中'Construction of a prognostic model based on ADCP-related genes'，Figure 5 |
| 免疫浸润分析 | CIBERSORT算法输入基因矩阵和LM22.txt；高风险和低风险分组阈值（中位风险评分）。 阅读提示：见Methods中'Immune infiltration analysis'，Results中'Immune infiltration analysis'，Figure 6 |
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源（Zhongqiaoxinzhou Biotech）；培养基类型（DMEM, RPMI-1640, MEM）及补充物（10% FBS, 1% 青霉素-链霉素）；siRNA序列；转染试剂jetPRIME®的使用条件。 阅读提示：见Methods中'Cell culture'和'Transfection' |
| RT-qPCR | 引物序列（Supplementary Table S1）；内参基因GAPDH或18s；样本量（组织n=15，细胞系n=6）；数据表示为mean±SEM，至少三次独立实验。 阅读提示：见Methods中'RNA isolation and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction'，Figure 10B |
| 免疫组化 | 组织切片厚度5μm，一抗稀释度（CLDN18 1:400，GYPA 1:500）；样本量n=3。 阅读提示：见Methods中'Immunohistochemical staining'，Figure 10A |
| 迁移实验 | 细胞接种数量（Transwell上室200μL，下室500μL含10% FBS）；观察时间0-24小时；重复n=4。 阅读提示：见Methods中'Scratch test and migration'，Figure 10C, D |