HH化学成分鉴定
鉴定HH中的主要活性成分，为后续网络药理学分析提供基础。
采用UPLC-Q-TOF-MS对HH冻干粉进行分析，鉴定出29个化学成分。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
黄连-红曲药对通过NF-κB/NLRP3通路改善小鼠非酒精性脂肪性肝病：网络药理学、分子对接和实验验证
Huanglian-Hongqu herb pair improves nonalcoholic fatty liver disease via NF-κB/NLRP3 pathway in mice: network pharmacology, molecular docking and experimental validation.
实验完整度
高研究包括网络药理学预测、分子对接验证和体内动物实验，且体内实验包含功能验证（血脂、肝功能和病理）和机制验证（Western blot、qPCR）。
主要模型
C57BL/6小鼠高脂饮食诱导NAFLD模型 高脂饮食喂养小鼠
重点核对
动物模型：雄性C57BL/6小鼠，6周龄，高脂饮食（HFD）诱导NAFLD，对照组给予标准饮食 分组与剂量：分为对照组、NAFLD组、HH低剂量组（250 mg/kg）、中剂量组（500 mg/kg）、高剂量组（1000 mg/kg），口服给药6周 检测指标：血清脂质（TC、TG、LDL-C、HDL-C）、肝功能（ALT、AST）、肝脏脂质（TC、TG、FFA） 炎症因子检测：ELISA检测血清IL-6和TNF-α，qPCR检测肝脏IL-18、IL-1β、IL-6 mRNA表达 机制检测：Western blot检测NF-κB、p-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-IL-1β蛋白表达
摘要
黄连-红曲药对（HH）是一种精心配制的传统中药复方，旨在解决葡萄糖和脂质代谢相关疾病，主要用于治疗高脂血症和脂肪肝。本研究通过网络药理学、分子对接和体内动物实验探讨了HH治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的潜在机制。采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱（UPLC-Q-TOF-MS）鉴定HH的化学成分。利用网络药理学分析HH影响的相关信号通路。随后，通过动物实验验证预测结果。最后，我们在HH中鉴定出29个成分。网络药理学揭示了HH与153个NAFLD相关靶点的相互作用，强调HH可能通过NF-κB信号通路缓解NAFLD。分子对接分析阐明了HH成分与关键调控蛋白（包括NF-κB、NLRP3、ASC和Caspase-1）的结合相互作用。体内实验表明，HH通过降低血清和肝脏脂质水平、改善肝功能、降低血清炎症细胞因子水平来缓解NAFLD。此外，HH给药下调了NF-κB/NLRP3通路的mRNA和蛋白水平。总之，我们的研究结果表明，HH通过靶向NF-κB/NLRP3通路在改善NAFLD方面具有潜在治疗益处，促进HH在NAFLD领域的更广泛应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究探讨黄连-红曲药对（HH）治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的潜在分子机制，特别是其是否通过NF-κB/NLRP3信号通路发挥治疗作用。
- 核心机制
- HH通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路，下调下游炎症因子（如IL-1β、IL-18、IL-6）的表达，从而减轻肝脏炎症和脂质沉积。
- 主要证据
- 体内实验显示，HH降低HFD喂养小鼠的血清和肝脏脂质水平、改善肝功能，并减少肝脏脂肪变性和炎症；Western blot和qPCR结果显示HH下调p-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-IL-1β及炎症因子mRNA水平。
- 研究意义
- 研究结果表明HH通过靶向NF-κB/NLRP3通路在改善NAFLD方面具有潜在治疗益处，促进HH在NAFLD领域的更广泛应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
网络药理学分析
预测HH治疗NAFLD的潜在靶点和信号通路。
通过Swiss TargetPrediction预测HH成分靶点，与DisGeNET和GeneCards数据库获取的NAFLD靶点取交集，获得153个共同靶点；构建PPI网络和药物-成分-靶点-疾病网络；进行GO和KEGG富集分析。
分子对接验证
验证HH中主要化合物与NF-κB/NLRP3通路关键蛋白的结合活性。
选取7个高峰化合物与NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1进行分子对接，计算结合能。
动物模型建立与HH给药
建立NAFLD小鼠模型并评估HH的治疗效果。
雄性C57BL/6小鼠适应性喂养7天后，随机分为对照组（标准饮食）和模型组（高脂饮食），喂养16周后评估模型，再将模型组随机分为NAFLD组和HH低、中、高剂量组，口服给药6周。
血清和肝脏指标检测
评估HH对小鼠血脂、肝功能和肝脏脂质的影响。
检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST水平和肝脏TC、TG、FFA水平。
肝脏组织病理学分析
评估HH对肝脏脂肪变性和炎症的改善作用。
通过HE染色和油红O染色观察肝脏病理变化，并计算NAS评分和油红O面积。
炎症因子检测
评估HH对炎症反应的影响。
ELISA检测血清IL-6和TNF-α水平；qPCR检测肝脏IL-18、IL-1β、IL-6的mRNA表达。
机制蛋白表达检测
验证HH对NF-κB/NLRP3信号通路蛋白表达的影响。
Western blot检测肝脏中NF-κB、p-NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-IL-1β蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
化学成分鉴定
分子对接
血清生化指标检测
肝脏脂质检测
蛋白表达检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| HH制备 | 黄连 | 四川国强中药颗粒有限公司 | 21,090,101 |
| 红曲 | 雅安迅康药业有限公司 | 210,501 | |
| 动物实验 | 高脂饮食 | 成都派尚菲克生物科技有限公司 | D12492 |
| 血清生化检测 | 总胆固醇检测试剂盒 | Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. | 105-000448-00 |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. | 105-000449-00 | |
| 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. | 105-000464-00 | |
| 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. | 105-000463-00 | |
| 谷丙转氨酶检测试剂盒 | Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. | 105-000442-00 | |
| 谷草转氨酶检测试剂盒 | Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. | 105-000443-00 | |
| Western blot | NF-κB抗体 | CST | 8242 |
| NLRP3抗体 | Bioss | bs-0169R | |
| Caspase-1抗体 | Bioss | bs-0169R | |
| ASC抗体 | Bioss | bs-6741R | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 磷酸化NF-κB抗体 | Abcam | ab76302 | |
| Cleaved-Caspase-1抗体 | 江苏亲科生物研究中心有限公司 | AF4005 | |
| Cleaved-IL-1β抗体 | 江苏亲科生物研究中心有限公司 | AF4006 | |
| 化学成分鉴定 | UltiMate 3000 RS色谱仪 | Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd. | -- |
| Q Exactive高分辨质谱仪 | Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd. | -- | |
| AQ-C18色谱柱 | Welch | 150×2.1 | |
| ELISA | IL-6和TNF-α ELISA试剂盒 | Multi Sciences | -- |
| qPCR | qPCR引物 | Sangon Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HH制备 | 黄连和红曲各10 g，10倍量水煎煮两次，每次30分钟，冻干粉得率16.25%。 阅读提示：Materials and methods, Materials and 'Identifier of active ingredients and targets of HH'部分 |
| 网络药理学 | Swiss TargetPrediction预测靶点，DisGeNET和GeneCards数据库获取NAFLD靶点，取交集获得153个共同靶点；STRING数据库PPI分析（最小combined score 0.700，物种为Homo Sapiens）。 阅读提示：Materials and methods, 'Acquisition of NAFLD-associated targets', 'PPI analysis', 'Network construction', 'GO and KEGG pathway enrichment analysis'部分 |
| 分子对接 | 使用Autodock Vina 1.2.2，蛋白质结构PDB ID：NF-κB (1LE9), NLRP3 (6NPY), ASC (6N1H), Caspase-1 (2FQQ)；结合能阈值<-4.25 kcal/mol表示有结合活性，<-5.0 kcal/mol表示良好。 阅读提示：Materials and methods, 'Molecular docking'部分 |
| 动物模型及给药 | 雄性C57BL/6小鼠，6周龄；HFD（60 kcal% fat）或标准饮食喂养16周建模；对照组n=6，NAFLD组n=6，HH-L 250 mg/kg，HH-M 500 mg/kg，HH-H 1000 mg/kg；口服给药6周；处死使用10%戊巴比妥钠。 阅读提示：Materials and methods, 'Animal experiment'和'HH preparation and NAFLD modeling'部分 |
| 血清生化检测 | 禁食12小时后采集尾静脉血，使用Mindray自动生化分析仪检测TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST。 阅读提示：Materials and methods, 'Serum levels of TC, TG, LDL-C, HDL-C, ALT, and AST'部分 |
| 肝脏脂质检测 | 肝组织用9倍冰冷生理盐水匀浆，离心3000 r/min，4°C 20分钟；用BCA法测蛋白浓度；检测TC、TG、FFA。 阅读提示：Materials and methods, 'Liver levels of TC, TG, and free fatty acid (FFA)'部分 |
| 组织病理学 | 肝组织用4%多聚甲醛固定，HE染色；另一部分用30%蔗糖处理48小时，OCT包埋，切片5 μm，油红O染色；计算NAS评分和油红O面积。 阅读提示：Materials and methods, 'Histopathology'部分 |
| 炎症因子检测 | ELISA检测血清IL-6和TNF-α；qPCR检测肝脏IL-18、IL-1β、IL-6 mRNA表达，使用2-ΔΔCT法计算相对表达量，引物序列见表1。 阅读提示：Materials and methods, 'ELISA for serum IL-6 and TNF-α'和'qPCR analysis'部分 |
| Western blot | 肝组织（100 mg）冰上裂解，BCA法测蛋白，SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，5%脱脂牛奶封闭1小时，一抗（NF-κB, p-NF-κB, NLRP3, ASC, Caspase-1）1:1000稀释，4°C孵育过夜，二抗37°C孵育2小时；内参β-Actin；至少重复三次。 阅读提示：Materials and methods, 'Western blot analysis'部分 |