OGD/R诱导心肌细胞损伤模型
建立体外MIRI模型，观察心肌细胞活力、焦亡及相关蛋白表达的改变。
AC16和HL-1细胞经过氧糖剥夺（OGD）2、4、8或12小时，然后复氧6小时。检测细胞活力（CCK-8）、焦亡（流式Caspase-1/PI双阳性）、蛋白表达（Western blot）及IL-18/IL-1β释放（ELISA）。
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STUB1被KAT5乙酰化，并通过LATS2-YAP-β-catenin轴减轻心肌缺血再灌注损伤
STUB1 is acetylated by KAT5 and alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury through LATS2-YAP-β-catenin axis.
实验完整度
高包含体外OGD/R模型和体内小鼠MIRI模型，并进行了功能验证（CCK-8、流式）、机制验证（Co-IP、ChIP、双荧光素酶）和体内评估（TTC、HE、超声心动图）。
主要模型
AC16人心肌细胞 HL-1小鼠心肌细胞 C57BL/6小鼠心肌缺血再灌注模型
重点核对
心肌细胞类型（AC16和HL-1）及OGD/R处理时间（2、4、8、12小时） 动物模型（C57BL/6小鼠）及缺血45分钟再灌注2、4、8、12小时，后续实验选择再灌注4小时 细胞转染使用的慢病毒载体（sh-KAT5、KAT5过表达等）及体内注射腺病毒（1×10^10 VP/mL） LATS2敲低或过表达对细胞活力（CCK-8）和焦亡（流式Caspase-1/PI双阳性）的影响
摘要
心肌缺血再灌注损伤（MIRI）参与多种心血管疾病的发病过程。本研究阐明了赖氨酸乙酰转移酶5（KAT5）在MIRI期间心肌细胞焦亡中的生物学功能。采用氧糖剥夺/复氧和左前降支冠状动脉结扎建立MIRI模型。研究表明，在MIRI模型中KAT5和STIP1同源性和U-box包含蛋白1（STUB1）下调，而大肿瘤抑制激酶2（LATS2）上调。KAT5/STUB1过表达或LATS2沉默抑制心肌细胞焦亡。机制上，KAT5通过乙酰化修饰促进STUB1转录，进而引起LATS2的泛素化和降解，从而激活YAP/β-catenin通路。值得注意的是，STUB1过表达对心肌细胞焦亡的抑制作用被LATS2过表达或KAT5耗竭所取消。我们的发现表明，KAT5过表达通过调节STUB1/LATS2/YAP/β-catenin轴抑制NLRP3介导的心肌细胞焦亡以减轻MIRI，为MIRI提供了一个潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KAT5是否通过调节STUB1表达进而影响LATS2-YAP-β-catenin轴，从而在心肌缺血再灌注损伤中调控NLRP3介导的心肌细胞焦亡？
- 核心机制
- KAT5通过乙酰化修饰促进STUB1转录，STUB1作为E3泛素连接酶促进LATS2的泛素化降解，从而激活YAP/β-catenin通路，抑制NLRP3炎症小体介导的心肌细胞焦亡，减轻MIRI。
- 主要证据
- 在体外OGD/R模型和体内小鼠MIRI模型中，KAT5过表达或STUB1过表达抑制心肌细胞焦亡，而LATS2过表达或KAT5敲低逆转此效应；ChIP和双荧光素酶实验验证KAT5直接结合STUB1启动子，Co-IP实验验证STUB1与LATS2相互作用。
- 研究意义
- 该研究首次揭示了KAT5在MIRI中的保护机制，提示KAT5可能成为MIRI的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LATS2功能验证
探讨LATS2对OGD/R诱导心肌细胞损伤的影响。
使用sh-LATS2或LATS2过表达慢病毒转染细胞，然后进行OGD/R处理。检测细胞活力、焦亡、Caspase-1表达、相关蛋白表达及IL-18/IL-1β释放。
STUB1与LATS2相互作用验证
验证STUB1是否作为E3泛素连接酶促进LATS2的泛素化和降解。
通过Ubibrowser预测LATS2的E3连接酶，RT-qPCR筛选STUB1。用sh-STUB1或STUB1过表达慢病毒转染细胞，检测STUB1和LATS2蛋白水平；Co-IP验证外源和内源相互作用；MG132抑制蛋白酶体后检测LATS2水平；CHX追踪实验观察蛋白降解；泛素化实验检测LATS2泛素化水平。
STUB1功能验证
验证STUB1是否通过调节LATS2/YAP/β-catenin轴影响OGD/R诱导的心肌细胞损伤。
在AC16和HL-1细胞中共转染STUB1和LATS2过表达慢病毒（或单独），然后进行OGD/R处理。检测细胞活力、焦亡、Caspase-1表达、相关蛋白表达及IL-18/IL-1β释放。
KAT5对STUB1转录调控验证
验证KAT5是否通过乙酰化组蛋白修饰促进STUB1转录。
利用UCSC预测H3K27ac在STUB1启动子的富集；检测OGD/R后KAT5、GCN5、CBP蛋白水平；双荧光素酶报告实验检测KAT5、GCN5、CBP对STUB1启动子活性的影响；ChIP验证KAT5直接结合STUB1启动子；ChIP-re-ChIP验证KAT5与H3K27ac相互作用。
KAT5功能验证
验证KAT5对OGD/R诱导心肌细胞损伤的影响。
使用sh-KAT5或KAT5过表达慢病毒转染细胞，然后进行OGD/R处理。检测细胞活力、焦亡、Caspase-1表达、相关蛋白表达及IL-18/IL-1β释放。
体内小鼠MIRI模型验证
验证KAT5在体内对MIRI的保护作用。
对C57BL/6小鼠进行左前降支冠状动脉结扎45分钟，再灌注2、4、8、12小时。通过腺病毒介导KAT5敲低或过表达，检测心肌梗死面积（TTC）、病理变化（HE）、细胞死亡（TUNEL）、心功能（超声）、血清LDH/CK-MB、相关蛋白表达和细胞因子水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| Lipofectamine2000转染试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Dojindo | CK04 |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 心肌梗死面积检测 | TTC | -- | -- |
| 免疫组化 | 抗KAT5抗体 | Bioss | bs-13686R |
| 抗STUB1抗体 | Abcam | ab134064 | |
| 抗LATS2抗体 | Bioss | bs-4081R | |
| 抗YAP抗体 | Bioss | bs-3605R | |
| 抗β-catenin抗体 | Abclonal | A19657 | |
| 抗NLRP3抗体 | Thermo Fisher | MA5-32255 | |
| 血清生化检测 | 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 |
| 肌酸激酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | H197-1-2 | |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒（HRP-DAB） | Abcam | ab206386 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| RT-qPCR | RT预混液（qPCR II） | MCE | HY-K0510A |
| 2×SYBR Green PCR预混液 | Solarbio | SR1110 | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| 抗KAT5抗体 | Bioss | bs-13686R | |
| 抗STUB1抗体 | Abclonal | A11751 | |
| 抗LATS2抗体 | Bioss | bs-4081R | |
| 抗p-YAP抗体 | Bioss | bsm-52214R | |
| 抗YAP抗体 | Bioss | bs-3605R | |
| 抗β-catenin抗体 | Abclonal | A19657 | |
| 抗NLRP3抗体 | Abclonal | A5652 | |
| 抗ASC抗体 | Bioss | bs-6741R | |
| 抗Caspase-1抗体 | Abclonal | A0964 | |
| 抗IL-18抗体 | Abclonal | A1115 | |
| 抗IL-1β抗体 | Abclonal | A16288 | |
| 抗β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| ECL Western blot底物 | Solarbio | PE0010 | |
| 免疫荧光 | 抗Caspase-1抗体 | Abclonal | A0964 |
| Cy3标记的山羊抗兔IgG | Abclonal | -- | |
| ELISA | 人IL-18 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKH-0028 |
| 小鼠IL-18 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0019 | |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKH-0002 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0002 | |
| Co-IP | 抗泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 |
| 抗IgG抗体 | Abclonal | AC005 | |
| ChIP | ChIP检测试剂盒 | Millipore | 17-371 |
| 抗KAT5抗体 | Novus Biologicals | NBP2-20647 | |
| 抗H3K27Ac抗体 | Epigentek | A-4708-050 | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | RG027 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外OGD/R模型 | 细胞系（AC16和HL-1）、OGD时间（2,4,8,12小时）、复氧时间（6小时）、检测指标（活力、焦亡、蛋白表达、细胞因子） 阅读提示：Materials and methods: 细胞培养和体外MIRI模型; Figure 1 legend |
| LATS2功能验证 | 转染效率（sh-LATS2和LATS2过表达）、OGD/R处理、检测指标（细胞活力、焦亡、蛋白表达、细胞因子） 阅读提示：Materials and methods: 细胞培养和转染; Figure 2 legend |
| STUB1与LATS2相互作用 | Co-IP实验使用的抗体（STUB1, Ubiquitin, IgG）、MG132浓度（100 nM）和时间（48小时）、CHX浓度（50 μg/mL）和时间点（0,15,30,60,120,240分钟） 阅读提示：Materials and methods: 免疫共沉淀; Figure 3 legend |
| KAT5对STUB1转录调控 | ChIP实验使用的抗体（KAT5, H3K27Ac）、双荧光素酶报告基因实验使用的报告质粒（WT和MUT） 阅读提示：Materials and methods: ChIP和双荧光素酶报告基因实验; Figure 6 legend |
| KAT5功能验证 | 转染效率（sh-KAT5和KAT5过表达）、OGD/R处理、检测指标（细胞活力、焦亡、蛋白表达、细胞因子） 阅读提示：Materials and methods: 细胞培养和转染; Figure 5 legend |
| 体内小鼠MIRI模型 | 小鼠品系和年龄（6-8周龄雄性C57BL/6）、缺血时间（45分钟）和再灌注时间（2,4,8,12小时，后续实验选4小时）、腺病毒注射剂量（1×10^10 VP/mL）和方式（心肌注射）、每组动物数（5只） 阅读提示：Materials and methods: 动物模型; Figure 7 and 8 legends |